Zusammenfassung

Das Oberflächenglykoprotein CD44 ist in Embryonalentwicklung, Metastasierung, T-Zellaktivierung, Hämopoiese und "Lymphozyten-Homing" involviert. Die Aktivierung von CD44 in T-Zellen mit dem natürlichen Liganden Hyaluronsäure oder mit aktivierenden CD44-Antikörpern induziert eine alternative Signalkette. Diese ist der bereits sehr gut charakterisierten Signalübertragung, die nach Aktivierung des T-Zell-Rezeptors/CD3-Komplexes induziert wird, sehr ähnlich. Daraus ergab sich die Fragestellung, welche Kinasen an der Signalübertragung von CD44 beteiligt sind.

Der humane CD44-Antikörper J-173 und der bisher noch nicht näher charakterisierte humane CD44-Antikörper D2.1 koaktivieren sowohl die homotypische T-Zellaggregation als auch das T-Zellwachstum. Die Bindung der Antikörper an CD44 aktivierte Proteine von 200, 150, 120, 112, 100, 84, 59, 56, 42, 38 und 35 kDa. Unter diesen Proteinen waren Lck und Erk2.

Untersuchungen in der Maus mit den inhibierenden CD44-Antikörpern IM7, KM81 und
einem KM81 F(ab‘)₂-Fragment hemmten die CD3-induzierte Interleukin-2 Produktion und
T-Zellproliferation (aktivierende Antikörper waren in der Maus nicht verfügbar). Es wurden Tyrosin-phosphorylierte Proteine von 120, 100, 84, 80 und 35 kDa sowie Erk2 (42 kDa) gehemmt. Die Spezifität der Antikörper wurde mit T-Zellen aus CD44-"Knockout" Mäusen demonstriert. In diesen T-Zellen hatten die Antikörper keinen Einfluß auf eine CD3-induzierte Aktivierung. Die Hemmung durch CD44-Antikörper auf die CD3 Signalübertragungskette erfolgte stromabwärts der T-Zell-Rezeptor-z -Kette.

Die Tyrosin-Phosphorylierung intrazellulärer Proteine von 56, 120 und vor allem von 84 kDa kann in murinen T-Zellen auch durch Hyaluronsäure induziert werden. Dazu müssen ruhende T-Zellen durch Voraktivierung z.B. mit Phorbolestern befähigt werden, Hyaluronsäure zu binden. Diese Bindung wird durch CD44 und nicht durch einen anderen Hyaluronsäure-Rezeptor vermittelt. Überraschenderweise wurde Erk2 nicht mit Hyaluronsäure aktiviert. Folglich gibt es Unterschiede in der Signalübertragung nach Aktivierung mit CD44-Antikörpern bzw. Hyaluronsäure.

Ein Protein mit 84 kDa wird sowohl durch Hyaluronsäure als auch durch CD3-Antikörper besonders stark phosphoryliert. Es scheint auch im CD44-Signalweg zu liegen, weil hemmende, gegen CD44 gerichtete Antikörper seine Phosphorylierung unterdrücken und aktivierende seine Phosphorylierung bewirken. Da das Molekulargewicht dieses Proteins nicht mit den naheliegendsten Kandidaten, der 85 kDa-Untereinheit der PI3-Kinase, Ezrin, Stat1b bzw. Stat3b übereinstimmte, ist dessen Identität unklar. Dieses Protein wurde daher HARP (für "Hyaluronic Acid Responding Phosphoprotein") genannt. Um HARP aufzureinigen und mit Hilfe einer massenspektrometrischen Analyse zu identifizieren, wurden die Proteinlysate mit einer Ionenaustauschersäule aufgetrennt und einer quantitativen Immunpräzipitation mit einem Phospho-Tyrosin-Antikörper unterzogen. Die präzipitierten Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und mit Silber angefärbt. Die Sichtbarmachung von HARP im Silbergel war bisher, im Gegensatz zu dem oben erwähnten 120 kDa Protein, nicht möglich.

Signal transduction of CD44 in T-lymphocytes

Abstract

The surface glycoprotein CD44 is involved in embryonal development, metastasis, T-cell activation, haemopoiese and lymphocyte-homing. CD44 can be activated in T-cells by hyaluronic acid, its natural ligand, or activating CD44-antibodies. This triggers a signal transducing pathway similar to one activated by T-cell receptor/CD3-complex in T-cells. The aim of this work is to identify which kinases are involved in the signaling pathway triggered by CD44.

The human CD44-antibody J-173 and D2.1 (uptill now uncharacterized) coactivate the homotypic T-cell aggregation and the T-cell growth. The binding of these antibodies to CD44 activates proteins of 200, 150, 120, 112, 100, 84, 59, 56, 42, 38 and 35 kDa as identified by tyrosine phosphorylation. Among these proteins Lck and Erk2 were identified.

Experiments in the mouse system with the inhibiting CD44-antibodies, IM7, KM81 and a KM81 F(ab‘)₂-fragment inhibited the CD3-induced interleukin-2 production and T-cell proliferation (activating CD44-antibodies in the mouse system were not available at the time). Tyrosine-phosphorylated proteins of 120, 100, 84, 80 and 35 kDa as Erk2 (42 kDa) were inhibited. The specificity of antibodies in T-cells was demonstrated from CD44-"Knockout" mice. In these T-cells the antibodies had no effect on the CD3-induced Erk2 activation. The T-cell-receptor-z -chain was found to be not involved, therefore the inhibition with CD44-antibodies on the CD3 signal transduction must be upstream to the T-cell-receptor-z -chain.

The tyrosine-phosphorylation of intracellular proteins of 56, 120 and mainly of 84 kDa were also induced in murine T-cells with hyaluronic acid. Binding of hyaluronic acid in resting T-cells must be induced upon a preactivation with phorbolester. This binding is mediated through CD44 alone. Surprisingly Erk2 is not activated by hyaluronic acid. Therefore there are differences between the signaling pathways after activation with CD44-antibodies or hyaluronic acid.

A protein of 84 kDa is strongly phosphorylated upon hyaluronic acid treatment of murine and human lymphocytes as well as with CD3 antibodies. It appears to be in the CD44 signaling pathway, since inhibiting CD44 antibodies suppresses and activating antibodies induce its phosphorylation. Since the molecular weight of this protein does not agree with that of obvious candidates such as the 85 kDa subunit of PI3-kinase, Ezrin, Stat1b or Stat3b , its identity remains unclear. Therefore, this protein was called HARP (for "Hyaluronic Acid Responding Phosphoprotein"). In order to purify and subsequently to identify HARP mass spectrometric analysis would be utilized. Protein lysates were separated with an ion exchange column and this lysates were immunoprecipitated with a phospho-tyrosine-antibody. The precipitated proteins were separated by electrophoresis and then stained with silver. Unfortunately HARP was not visible to that end in the silver gele.