Kompensatorische Mechanismen in CD44-defizienten Mäusen.

Zusammenfassung

CD44 ist eine Familie transmembraner Glycoproteine, denen eine Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie zum Beispiel bei der Embryonalentwicklung, der Hämatopoese, in der Immunantwort, bei Tumorwachstum und der Bildung von Metastasen zugeschrieben wurde. Interessanterweise zeigen Mäuse, bei denen alle Isoformen von CD44 durch gezielte Mutagenese ausgeschaltet worden sind, keine offensichtlichen embryonalen oder immunologischen Abnormalitäten; lediglich ein geringfügiger Defekt in der Hämatopoese wurde beobachtet (Schmits et al., 1997). Daraus wurde geschlussfolgert, dass Mäuse, bei denen CD44 genetisch defekt ist, einen kompensatorischen Mechanismus benutzen, der einen funktionellen Ausgleich schafft. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Veränderungen zu untersuchen, die in CD44-defekten Mäusen für den Mangel an CD44 kompensieren. Die Suche nach einem kompensatorischen Molekül basierte auf den Bindungseigenschaften von CD44 für spezifische Liganden, die potenzielle CD44-substituierende Moleküle definieren könnten.

Da Hyaluronsäure als einer der Hauptliganden fur CD44 bekannt ist, wurde die Hyaluronsäure-Bindekapazität von verschiedenen primären Mauszellinien untersucht: Primäre, embryonale Fibroblasten von Wildtyp-Mäusen banden weder an lösliche noch an immobilisierte Hyaluronsäure, solange sie nicht in geringer Dichte kultiviert wurden. Sowohl die Stärke der CD44-Expression als auch die CD44-abhängige Hyaluronsäure-Bindung durch embryonale Fibroblasten von Wildtyp-Mäusen verhielt sich umgekehrt proportional zur Zelldichte. Im Gegensatz zum Wildtyp hatten embryonale Fibroblasten von CD44-defekten Mäusen überhaupt keine messbare Affinität zu Hyaluronsäure, ganz gleich unter welchen Bedingungen oder welcher Dichte sie kultiviert worden waren. Auch onkogene Transformation stimulierte die Hyaluronsäure-Bindung von embryonalen Fibroblasten nicht. Von den anderen untersuchten Zellinien banden ruhende und Thioglykolat-induzierte peritoneale Makrophagen der Wildtyp-Mäuse an Hyaluronsäure. Allerdings war diese Affinität CD44-unabhängig, da sie nicht durch den Antikörper KM81 blockiert wurde, der mit der Bindung von CD44 an Hyaluronsäure interferiert. Die bereits beschriebene CD44-abhängige Hyaluronsäure-Bindung von Interleukin 5-stimulierten B-Zellen aus DBA/2-Mäusen (Murakami et al., 1990) war offenbar spezifisch für diesen Stamm. Dieser Befund machte es unmöglich, nach kompensatorischen Molekülen in B-Zellen zu suchen, denn die CD44 defekten Mäuse gehören der C57Bl6/J-Linie an, die diese Affinität nicht zeigt. T-Zellen, die aus Lymphknoten von C57Bl6/J und Balb/c Mäusen isoliert worden waren, entwickelten nach Stimulation mit einem Anti-CD3 Antikörper eine Subpopulation von Zellen, die CD44-abhängig an Hyaluronsäure banden. Im Gegensatz dazu entwickelten T-Zellen aus Lymphknoten von CD44-defekten C57Bl6/J-Mäusen keine Subpopulation, die eine CD-3-vermittelte Affinität zu Hyaluronsäure aufwies.

Diese Befunde lassen vermuten, dass in den untersuchten Zelltypen von CD44-defekten C57Bl6/J-Mäusen kein Ersatz für die CD44 abhängige Hyaluronsäure-Bindung besteht. In Sherman et al., 1998 wurde gezeigt, dass eine Heparan-Sulfat modifizierte Proteoglykan-Form von CD44 dazu diente, Fibroblasten Wachstumsfaktor 4 (FGF-4) und FGF-8 zu präsentieren und somit das Wachstum der sich entwickelnden Gliedmassenknospe zu regulieren. Um ein Molekül zu identifizieren, das in CD44-defekten Mäusen diese Rolle übernimmt, wurden Menge und Muster mesenchymaler Heparan-Sulfat modifizierter Proteoglykane in CD44-positiven und CD44-negativen embryonalen Gliedmassenknospen verglichen. Die Gesamtmenge an Heparan-Sulfat an der äusseren Zellmembran mesenchymaler Zellen war gleich, jedoch wurden in den embryonalen Gliedmassenknospen von CD44-defekten Mäusen drei Heparan-Sulfat modifizierte Proteoglykane mit niedrigem Molekulargewicht verstärkt exprimiert. Diese Proteoglykane könnten als Ersatz fur CD44 dienen und FGF in CD44 defizienten Gliedmassenknospen präsentieren.

Abstract

CD44 is a closely related family of transmembrane glycoproteins, which have been implicated in a number of physiological and pathological phenomena such as embryonic development, hemopoiesis, immune response, tumour growth and metastasis formation. However, mice with a gene-targeted disruption of all CD44 isoforms do not display any overt embryological or immune abnormalities, having only a minor defect in the hemopoietic system (Schmits et al., 1997). It was therefore concluded that the CD44-deficient mice utilize compensatory mechanisms in order to overcome the need for CD44. The goal of the work in this thesis was to investigate the changes in CD44-mutant mice which compensate for the lack of CD44. The search was based on the ligand binding properties of CD44 which may define the potential CD44 -substitutive molecule or molecules.

Since hyaluronic acid (HA) is known to be a major CD44 ligand, the hyaluronic acid binding capacity of different primary mouse cell types was examined. Primary embryonic fibroblasts from wild-type mice did not bind to soluble and immobilized hyaluronic acid, unless they were cultured at low confluency. The level of CD44 expression and the CD44-dependent hyaluronic acid binding by embryonic fibroblasts from the wild-type mice was found to inversly correlate with cell density. In contrast to the wild-type, embryonic fibroblasts obtained from the CD44-deficient mice did not show any hyaluronic acid binding under any culturing conditions, including a low confluency. Oncogenic transformation did not stimulate hyaluronic acid binding in CD44-deficient embryonic fibroblasts. As to the other cell types tested, resident and thioglycollate-elicited peritoneal macrophages obtained from the wild-type mice bound hyaluronic acid. However this binding was CD44-independent, since it was not blockable by KM81, the anti-CD44 antibody interferring with hyaluronic acid binding of CD44. The previously described CD44-dependent HA binding of a subpopulation of interleukin-5 stimulated B-cells derived from DBA/2 mice (Murakami et al., 1990) appeared to be strain specific. This made it impossible to look for a substitution of CD44-dependent HA binding in the B-cells derived from CD44-deficient mice generated on the C57Bl6/J background. Lymph node T-cells derived from both C57Bl6/J and Balb/c mice developed a subpopulation of cells binding HA in a CD44-dependent manner upon stimulation with anti-CD3 antibody, although the hyaluronic acid binding subpopulation was somewhat smaller in the C57Bl6/J derived cells. In contrast, lymph node-derived T-cells from CD44-deficient mice did not develop a hyaluronic acid binding subpopulation upon treatment with anti-CD3 antibody. Together, this suggests that CD44-dependent hyaluronic acid binding is not substituted in the cell types tested in CD44-deficient C57Bl6/J mice.

A heparan sulfated proteoglycan form of CD44 has been previously shown to serve as a FGF4 and FGF8-presenting molecule in the developing limb bud, thus regulating limb outgrowth (Sherman et al., 1998). To find the substitutive molecule(s) taking over this function of CD44 in CD44-deficient developing limb buds, the amount and pattern of mesenchymal heparan sulfated proteoglycans from CD44-positive and CD44-negative embryonic limb buds were compared. The total level of surface heparan sulfate was equivalent in both wild-type and CD44-deficient limb bud mesenchymal cells. However, in the CD44-negative limb bud mesenchyme, 3 low molecular weight heparan sulfated proteoglycans were significantly upregulated compared to the wild-type cells. These are possible candidates for CD44 substitutive molecules which present FGFs in CD44-deficient embryonic limb buds.