Zusammenfassung

Diese Arbeit befasste sich mit der Entwicklung miniaturisierter optochemischer Sensoren zur Bestimmung der Kalium- bzw. Chloridionenkonzentration sowie des pH-Wertes, deren sensitive Fläche einen Durchmesser von 50 nm aufwies. Die Signalübertragung erfolgte mit Lumineszenzfarbstoffen, zur Detektion wurde einerseits die Intensität, andererseits die Lebensdauer der Lumineszenz herangezogen.

Als Beispiel für die Auswertung der Intensität wurde ein Kalium-Sensor hergestellt, der auf dem Prinzip von Ionenaustausch-Optoden basierte, bei denen die Protolyse eines pH-sensitiven Lumineszenzfarbstoffs mit der Komplexierung von Kaliumionen gekoppelt wird. Zusätzlich zu dem Messfarbstoff mit seinem veränderlichen Signal wurde noch ein Referenzfarbstoff mit konstantem Signal in die Rezeptorschicht eingebracht. Durch Auswertung des relativen Signals konnte eine deutliche Verbesserung der Signalstabilität erzielt werden. Der dynamische Kalium-Messbereich der Sensoren deckte extrazelluläre Kaliumionenkonzentrationen ab, und eine Unterscheidung von extra- und intrazellulären Konzentrationen war bis hin zur Nano-Version möglich. Die maximale Genauigkeit, die mit Nano-Sensoren erzielt werden konnte, lag bei 0,2 pK-Einheiten. Die Photostabilität sowohl des Mess- als auch des Referenzfarbstoffs war sehr gut. Selbst mit dem Nano-Sensor, der wegen seiner geringen Dimension die höchste Beleuchtungsstärke erfuhr, lassen sich gemäß einer Extrapolation der Bleichkurven etwa 23000 Messungen bis zum Auftreten eines 1%igen Messfehlers durch Photobleichen durchführen. Der Farbstoffaustrag war ebenfalls gering, ein 1%iger Fehler trat erst nach 17 Stunden kontinuierlicher Beprobung im Durchfluss auf. Eine Sauerstoffquerempfindlichkeit der Sensoren konnte nicht festgestellt werden.

Als alternativer Ansatz wurden Lebensdauer-Messungen durchgeführt, bei denen das Messsignal mittels phasenaufgelöster Detektion erhalten wurde. Bei dem pH-Sensor erfolgte die Änderung der Lumineszenz-Lebensdauer durch Resonanz-Energietransfer von angeregten Ruthenium-Komplexen auf Moleküle eines pH-Absorptionsindikators. Durch eine Kombination beider Farbstoffe mit verschiedenen Ionophoren wurden weiterhin Kalium- und Chlorid-Sensoren hergestellt. Sowohl der pH- als auch der Chlorid-Sensor waren geeignet für Messungen im physiologischen Bereich. Mit beiden Sensoren konnten bis zur Nano-Variante auf 0,1 pH- bzw. 0,1 pCl-Einheiten genaue Messungen durchgeführt werden. Bei Untersuchungen zur Photostabilität wie zum Farbstoffaustrag erwies sich die deprotonierte Form des Absorptionsindikators als limitierender Parameter. Dennoch können mit beiden Nano-Sensoren unter physiologischen Bedingungen etwa 1800 Messungen ohne Änderung des Sensorsignals durch Photobleichen durchgeführt werden. Beim Chlorid-Sensor war eine Sauerstoffquerempfindlichkeit gegeben, beim pH-Sensor konnte sie durch eine geeignete Wahl des Polymers eliminiert werden.

Investigations on Signal Stability of Miniaturised Optochemical Sensors based on Detection of Luminescence Intensity or Decay Time

Summary

Miniaturised optochemical sensors with a sensitive area of 50 nm diameter were developed to determine potassium and chloride concentrations as well as pH. The signal was transmitted by luminescent dyes the intensity or decay time of which was detected, respectively.

As an example for intensity based measurement a potassium sensor was developed based on the principle of ion-exchange optodes, combining the specific molecular recognition of potassium by a ligand with the optical transduction by a luminescent pH indicator. Additionally to the measuring dye with its changing intensity a reference dye with constant intensity was added, thus providing a highly reproducible ratio signal. The dynamic range of the sensors covered extracellular potassium concentration, a distinction of extra- and intracellular concentrations was possible. The measuring accuracy was 0.2 units of pK. Photostability of both the measuring and reference dye was excellent. Even with the nano-sensor (50 nm) 23000 measurements can be carried out before an error of 1% occurs. An error of 1% due to dye leaching occurred only after 17 hours of continuous rinsing of the sensor. The sensor showed no cross-sensitivity to oxygen.

Alternatively, decay time measurements were carried out using phase-modulated detection technique. A pH sensor was made combining a luminescent ruthenium-complex with the absorption indicator bromothymol blue the deprotonated form of which can diminish the luminescence lifetime by resonance energy transfer. By addition of a ionophore a chloride sensor based on the principle of ion coextraction was made. Both sensors were suitable for measurements at physiological concentrations and yielded an accuracy of 0,1 pH and 0,1 pCl, respectively. With respect to photostability and dye leaching, the deprotonated form of the absorption indicator was found to be the limiting factor. Yet with both sensors more than 1800 measurements can be carried out without a signal loss due to leaching or photobleaching at physiological concentrations. The chloride sensor is sensitive to quenching by oxygen, whereas the pH sensor shows no cross-sensitivity.