Zusammenfassung
Das Wilms Tumor Gen 1 (WT1) ist ein Tumorsuppressorgen, das bei einem pädiatrischen Nierenkrebs inaktiviert ist. Es kodiert für einen Transkriptionsfaktor mit einer C-terminalen DNA-Bindedomäne, welche aus vier Zinkfingern besteht. WT1 stellt eine Familie verschiedener Isoformen dar, die sich unter anderem in der Insertion von drei Aminosäuren (KTS) zwischen Zinkfinger drei und vier unterscheiden. Die damit verbundene Konformationsänderung verhindert die Bindung von WT1 an eine seiner Konsensussequenzen und resultiert in der Sequestrierung der entsprechenden Isoformen in subnukleären Domänen (Speckles).
Das für diese Lokalisation verantwortliche Fragment, die Speckling-Domäne, konnte im Rahmen dieser Arbeit identifiziert werden. Diese Domäne ist ausreichend und notwendig, um Wt1 sowie andere Proteine in Speckles zu dirigieren. Die Speckling-Domäne überlappt außerdem mit der minimalen Repressionsdomäne von Wt1 und stellt ein Mittel zur Analyse der entsprechenden nukleären Domänen und der Funktion der (+KTS)-Isoformen dar.
Wie für viele andere Transkriptionsfaktoren mit nukleärer Lokalisation konnte hier gezeigt werden, daß Wt1 posttranslationell durch Phosphorylierung modifiziert wird. Dabei handelt es sich um Phosphorylierung der Aminosäuren Serin und Threonin. Die Modifikation betrifft sowohl den für die DNA-Bindung verantwortlichen C-Terminus des Moleküls als auch den zentralen Bereich von Wt1, welcher die transaktivierende Domäne umfaßt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nicht geklärt werden, ob es sich bei der multiplen Phosphorylierung von Wt1 um eine konstitutive oder regulierte Modifikation handelt.
WT1 ist nicht nur ein Tumorsuppressor, sondern auch ein Faktor, der eine zentrale Rolle bei der Embryonalentwicklung spielt. In wt1-/--Mäusen sind verschiedene Organe entweder in ihrer Entwicklung gestört oder fehlen wie die Niere vollständig. Die Inaktivierung von wt1 resultiert außerdem in einer frühen embryonalen Letalität. Durch Einkreuzen der Mutation in andere Mausstämme konnte gezeigt werden, daß die Penetranz der wt1-Mutation durch mindestens eine weitere Mutation beeinflußt wird, denn die Embryonen mit einem gemischten genetischen Hintergrund überleben bis zur Geburt. Diese wt1-/--Embryonen besitzen nur eine rudimentäre Milz und detaillierte Untersuchungen zeigten, daß die Entwicklung der Milz bereits in einem frühen Stadium gestört ist. Dies ist auf eine erhöhte Apoptoserate im Milzprimordium zurückzuführen und spricht Wt1 eine antiapoptotische Funktion zu.
Mit der Milz konnte somit ein weiteres Organ beschrieben werden, für dessen Ausbildung Wt1 essentiell ist. Wie im Fall der Niere erfolgt auch bei der Entwicklung der Milz eine Differenzierung mesenchymaler zu epithelialen Strukturen. Diese Studie unterstreicht und erweitert damit die Bedeutung von Wt1 bei der Steuerung des genetischen Programmes zur Differenzierung bestimmter embryonaler Gewebe.
In vitro and in vivo studies on the function of the tumorsuppressor gene wt1
Abstract
The Wilms tumor gene 1 (WT1) is a tumorsuppressor gene, which is inactivated in pediatric kidney cancer. It encodes a transcription factor with a C-terminal DNA binding domain, which contains four zinc fingers. WT1 represents a family of several isoforms, which differ among others in the insertion of three amino acids (KTS) between zinc finger three and four. The subsequent conformational change inhibits the binding of WT1 to one of its consensus sequences and results in the sequestration of the respective isoforms in subnuclear domains (speckles).
The fragment responsible for this localisation could be identified through this work. This so-called speckling domain is sufficient and necessary to direct Wt1 and other proteins into speckles. The speckling domain overlaps with the minimal repression domain of Wt1 and provides a tool to analyse the respective nuclear domains and the function of (+KTS)-isoforms.
As with many other transcription factors with nuclear localisation, it could be demonstrated that Wt1 undergoes posttranslational modification via phosphorylation of the amino acids serine and threonine. This modification refers to the C-terminal DNA binding domain as well as a central region of Wt1, which comprises the transactivation domain. Within the scope of this work it could not be concluded, whether the phosphorylation is a constitutive or regulated modification.
WT1 is not only a tumorsuppressor, but also a factor, which plays a central role in embryonic development. In wt1-/- mice some organs are either impaired in their development or, like the kidney, are completely absent. The inactivation of wt1 also results in an early embryonic lethality. Crossing of the mutation in other mouse strains showed that the penetrance of the wt1 mutation is influenced by at least one other mutation, since embryos with a mixed genetic background survive until birth. These wt1-/- embryos have only a rudimentary spleen and detailed analysis showed that the development of the spleen is already disturbed at an early stage. This is due to an increased rate of apoptotic cells in the splenic primordium and suggests that Wt1 has an antiapoptotic function.
Thus the spleen is another organ where Wt1 is essential for proper development. As in the case of the kidney, during the development of the spleen a differentiation of mesenchymal to epithelial structures takes place. This study outlines and extends the importance of Wt1 in the regulation of genetic programs critical for the differentiation of certain embryonic tissues.