Zusammenfassung

Zur Entwicklung und Optimierung eines universell anwendbaren Verfahrens zur Biofunktionalisierung von Oberflächen für die Sensorik mit kommerziell erhältlichen akustischen Oberflächenwellen (OFW)-Bauelementen wurde eine Beprobungs- und Meßapparatur konzipiert und aufgebaut. Diese ermöglicht ein automatisiertes Beproben der OFW-Sensoren mit mehreren Analyten bzw. Reagenzien, sowie die gleichzeitige Aufnahme und Darstellung der Meßdaten.

Für die Anwendung in der Biosensorik ist ein Schutz der auf den Bauteilen befindlichen Aluminiumstrukturen notwendig, der durch eine Beschichtung des kompletten Bauteils mit einem polymeren Schutzüberzug aus Polyimid bzw. Parylen realisiert wurde.

Die Immobilisation einer Dextranschicht an der schutzbeschichteten Sensoroberfläche erfolgt über eine Coimmobilisation mit dem photoaktiven Reagenz T-BSA, das als Photovernetzer zwischen der polymeren Schutzbeschichtung und dem Dextran fungiert. Es konnte gezeigt werden, daß diese Methode weder durch das zu immobilisierende Dextran, noch durch das Oberflächenmaterial bzw. den Sensortyp beschränkt ist. Durch Verwendung unterschiedlich funktionalisierter Dextrane konnten mit Hilfe einfacher und schneller Standardprozeduren verschiedenste Proteine reproduzierbar immobilisiert werden. Dazu wurden literaturbekannte, an dextranbeschichteten optischen Sensoren angewandte Immobilisationsprozeduren an die Sensorik mit OFW-Bauelemente angepaßt. Die bei der Optimierung erhaltenen Abhängigkeiten konnten erstmals mit akustischen Sensoren nachgewiesen werden. Die so erzeugten dextranbeschichteten Biosensoren zeichneten sich unter anderem durch hohe Spezifität und geringe unspezifische Adsorptionen von Biomolekülen aus. Aufgrund der Immobilisation rezeptiver Moleküle innerhalb der gesamten dreidimensionalen gequollenen Dextranmatrix konnten um zwei Größenordnungen höhere Empfindlichkeiten erzielt werden, als dies bislang mit den gleichen OFW-Bauelementen bei Immobilisation von zweidimensionalen Rezeptorschichten möglich war. Die Regenerierbarkeit der Sensoroberfläche durch Lösen der gebildeten Immunokomplexe wurde nachgewiesen, wobei wiederholte Messungen mit dem gleichen Sensor eine Verbesserung von Reproduzierbarkeit, Schnelligkeit und Wirtschaftlichkeit der Analyse bedingen. Der Einsatz eines dextranbeschichteten OFW-Bauelementes in einem praxisrelevanten Anwendungsgebiet wurde anhand des chemotaktischen Cytokins ENA-78 dargestellt. Dabei wurden erstmals Messungen mit modifizierten kommerziellen OFW-Bauelementen in Seren durchgeführt. Sowohl in wäßrigen Lösungen, als auch in Seren war eine hohe Spezifität des Sensors gegeben.

Ein Ansatz zur Empfindlichkeitssteigerung, basierend auf dem Konzept der Anregung von Love-Wellen, wurde sowohl theoretisch als auch experimentell untersucht. Es wurden zwei Schichtmaterialien verglichen: Parylen und gesputtertes SiO₂. Die Bauteile wurden hinsichtlich ihrer Transmissionseigenschaften und Massesensitivität in Abhängigkeit von der Dicke der wellenführenden Schicht charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, daß die Aufbringung einer optimierten wellenführenden Beschichtung die Sensitivität der Bauelemente erhöht. Im Falle des SiO₂ ergab sich eine optimale Schichtdicke zwischen 3 und 4 µm, die zu einer Nachweisgrenze von 1,7 pg/mm² führte. Damit konnte die Nachweisgrenze gegenüber unbeschichteten STW-Bauteilen um den Faktor 7,7 verbessert werden. Die Untersuchungen an parylenbeschichteten Bauteilen zeigten, daß sich die ausgesprochen gute Schutzwirkung einer Parylenschicht vor korrosiven Angriffen des umgebenden Mediums mit einer Sensitivitätssteigerung gegenüber unbeschichteten STW-Bauelementen um den Faktor 4,3 (bei einer optimalen Parylen-Schichtdicke von 0,5 µm) kombinieren läßt.

Development of a universal process for biofunctionalization of surfaces to be used in sensor technology by surface acoustic wave (SAW) devices

Abstract

A sampling and measurement system has been conceived and constructed for the development and optimization of a universal process applied to biofunctionalize surfaces to be used in sensor technology by commercially available surface acoustic wave (SAW) devices. This system allows automatic sampling of the SAW sensors with several analytes or reactants as well as simultaneous recording and presentation of the measured data.

For use in biosensor technology, the aluminum structures located on the devices have to be protected. This is achieved by coating the complete device with a polymer layer of polyimide or parylene.

The dextran layer on the coated sensor surface is immobilized by means of co-immobilization using the photoactive reactant T-BSA. It acts as a photolinker between the polymer protective coating and dextran. It was demonstrated that this method is limited neither by the dextran to be immobilized nor by the surface material or sensor type. By using variably functionalized dextrans and simple, rapid standard procedures, various proteins were immobilized in a reproducible manner. For this purpose, immobilization procedures known from literature and applied to dextran-coated optical sensors were adapted to the needs of sensor technology with SAW devices. For the first time, the dependencies obtained by optimization could be demonstrated with acoustic sensors. The thus generated dextran-coated biosensors were characterized among others by a high specificity and small unspecific adsorptions of biomolecules. Due to the immobilization of receptive molecules within the entire three-dimensional swollen dextran matrix, the sensitivities achieved were higher by two orders of magnitude than those resulting from the immobilization of two-dimensional receptive layers with the same SAW devices. It was demonstrated that the sensor surface can be regenerated by dissolution of the immunocomplexes formed. Repeated measurements with the same sensor provided for an improved reproducibility, rapidity, and economic efficiency of the analysis. Based on the example of the chemotactic cytokine, ENA-78, use of a dextran-coated SAW device in a practically relevant field was illustrated. For the first time, measurements were performed with modified commercial SAW devices in serums. Both in aqueous solutions and serums, a high specificity of the sensor was achieved.

An approach to increase the sensitivity based on the excitation of Love waves was studied both theoretically and experimentally. Two materials of wave-guiding layers were compared: Parylene and sputtered SiO₂. The devices were characterized with regard to their transmission properties and mass sensitivity as a function of the thickness of the wave-guiding layer. It was demonstrated that the application of an optimized wave-guiding coating leads to an increase in sensitivity of the devices. In case of SiO₂, an optimum layer thickness of 3 - 4 m m was obtained. It led to a detection limit of 1.7 pg/mm². This value exceeds the detection limit of uncoated STW devices by a factor of 7.7. It was found out by investigations of parylene-coated devices that the excellent protective effect of a parylene layer against corrosive attacks by the surrounding medium is associated with an increase in sensitivity as compared to uncoated STW devices by a factor of 4.3 (at an optimum parylene layer thickness of 0.5 m m).