Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6714

Conditional Expression of CD44 Isoforms in Lymphoma Cells: Influence on Hyaluronate Binding and Tumor Growth

Jian Fu

Abstract
CD44 describes a family of surface proteins consisting of many isoforms due to alternative splice of ten ²variant² exons. Members of this family are involved in various processes including hematopoiesis, lymphocyte activation and homing, limb development, wound healing and tumor progression. Clinically, CD44 has been shown to be a prognostic factor for several human cancers.

To answer the question which isoform might be relevant for tumor progression and to gain an insight into the mechanism of its function, I established transfectants of the LB lymphoma cell line in which the expression of four CD44 isoforms, namely CD44v3-10, CD44v4-10, CD44v8-10 and CD44s, was controled by the Tet-off promoter. In the prescence of Doxycycline, the expression was repressed. Removal of Doxycycline switched on expression and the maximal CD44 amount was obtained within two days.

The transfectants were characterized regarding their ability to bind to the extracellular matrix component hyaluronate (HA). Overexpression of all four CD44 isoforms conferred the ability to bind HA on LB cells. Other glycosaminoglycans (GAGs) were bound in an isotype-specific fashion. CD44v3-10, CD44v4-10 and CD44v8-10 showed high binding affinity to chondroitin A, B and C, and low affinity to heparin, heparan sulfate and keratan sulfate. CD44s could not bind to these GAGs. Among these three variants, the binding ability of CD44v3-10 was the strongest.

CD44 clustering seemed to play a crucial role for HA binding. Both CD44s and CD44v8-10 formed reduction-sensitive complexes in LB cells. The complexes are homooligomers or heterooligomers composed of different isoforms. Cys286 in CD44 transmember domain was not responsible for the formation of reduction-sensitive oligomer or for the enhanced HA binding in LB cell line. Using a conditional dimerization system the requirement of CD44 oligomerization for HA binding was directly demonstrated. The induction of oligomerization increased HA binding.

Finally, I studied the role of CD44 in lymphoma development by subcutaneous injection of the transfectants in syngeneic or immunocompromised mice. I found no influence of CD44v3-10, CD44v4-10 and CD44v8-10 isoforms on the LB lymphoma formation and metastasis.

Konditionale Expression von CD44 Isoformen in Lymphomzellen: Einfluß auf Hyaluronsäurebindung und Tumorwachstum

Zusammenfassung
CD44 bezeichnet eine Familie von Zellmembranproteinen, die sich aus verschiedenen Isoformen zusammensetzt, die durch alternatives Spleissen von zehn „varianten“ Exons generiert werden. Mitglieder dieser Familie sind an unterschiedlichen Prozessen beteiligt, wie zum Beispiel an Hämatopoiese, Aktivierung und Homing von Lymphozyten, Gliedmaßenentwicklung, Wundheilung und Tumorprogression. Es wurde gezeigt, daß CD44 ein prognostischer Parameter für verschiedene Krebserkrankungen des Menschen ist.

Um die Frage zu beantworten, ob bestimmte CD44 Isoformen für die Tumorprogression relevant sind und um Einsicht in den Mechanismus ihrer Funktion zu erhalten, habe ich Transfektanten der LB Lymphomzelllinie etabliert, in denen die Expression von vier CD44 Isoformen, nämlich CD44v3-10, CD44v4-10, CD44v8-10 und CD44s, unter der Kontrolle des Tet-off Promotors steht. In der Anwesenheit von Doxyzyklin war die Expression reprimiert. Entfernung von Doxyzyklin schaltete die Expression ein und ein maximalen CD44 Proteingehalt wird nach zwei Tagen erhalten. Die Transfektanten wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bindung von Hyaluronsäure (HA) charakterisiert, einer Komponente der extrazellulären Matrix. Überexpression aller vier CD44 Isoformen bewirkte die Bindung von HA an LB Zellen. Andere Glykosaminoglykane (GAG) wurden in isotypspezifischer Weise gebunden. CD44v3-10, CD44v4-10 und CD44v8-10 zeigten eine hohe Bindungsaffinität für Chondroitin A, B und C, und eine niedrige Affinität zu Heparin, Heparansulfat und Keratansulfat. CD44s konnte an diese GAGs nicht binden. Unter den drei Variantenisoformen war die Bindungsfähigkeit von CD44v3-10 zu den GAGs am größten.

CD44 „Clustering“ scheint eine kritische Bedeutung für die Bindung von HA zu haben. Sowohl CD44s als auch CD44v8-10 bildeten reduktions-sensitive Komplexe in LB Zellen. Die Komplexe bestehen aus Homo- oder Heterooligomeren verschiedener CD44 Isoformen. Cys286 in der Transmembran-Domäne von CD44 war für die Bildung reduktions-sensitiver Oligomere und für die vermehrte HA-Bindung in LB Zellen nicht verantwortlich. In einem konditionalen Dimerisierungssystem wurde die Notwendigkeit der CD44 Oligomerisierung für die Bindung von HA direkt gezeigt. Die Induktion der Oligomerisierung verstärkte die Bindung von HA.

Abschließend untersuchte ich die Rolle von CD44 in der Entwicklung von Lymphomen durch subkutane Injektion der Transfektanten in syngene oder immundefiziente Mäuse. Ich fand keinen Einfluß von CD44v3-10, CD44v4-10 und CD44v8-10 Isoformen auf das Wachstum von Lymphomen und ihrer Metastasierungsfähigkeit.

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