Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6788

Links-Rechts-Achsenentwicklung im Kaninchenembryo: Klonierung von Markergenen, Etablierung eines in vitro Kultursystems und Identifizierung des Wachstumsfaktors FGF8 als rechte Determinante

Anja Fischer

Zusammenfassung
Die meisten der grundlegenden Mechanismen der embryonalen Achsenbildung sind zwischen den verschiedenen Wirbeltierklassen konserviert, wie z.B. das BMP-Signalsystem und seine Antagonisten bei der Enstehung der Dorsoventral- Achse. Eine markante Ausnahme bildet der Wachstumsfaktor FGF8, der bei der Entstehung der Links-Rechts-Asymmetrie in Huhn und Maus entgegengesetzte Funktionen beim Transfer eines noch nicht identifizierten asymmetrischen Signals aus dem Bereich der Mittellinie in die Peripherie wahrnimmt. Im Hühnerembryo wird fgf8 asymmetrisch auf der rechten Seite des Primitivknotens exprimiert und inhibiert die Transkription der Faktoren der linken Signalkaskade, nodal, Pitx2 und Lefty2 auf der rechten Seite. In der Maus wird fgf8 symmetrisch transkribiert. Ein hypomorphes Allel und Missexpressionsexperimente in kultivierten Maus- Embryonen weisen FGF8 eine instruktive Funktion auf der linken Seite bei der Induktion der Nodal-Signalkaskade zu. Diese Unterschiede könnten auf die unterschiedlichen Expressionsmuster, evolutionäre Unterschiede und die Architektur des frühen Embryos, der im Huhn eine flache Keimscheibe, in der Maus dagegen einen zylindrischen sog. Eizylinder bildet, zurückzuführen sein. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Funktion von FGF8 im Kaninchenembryo untersucht, der sich als Säuger über eine Keimscheibe entwickelt. Die Klonierung und Expressionsanalyse von Markergenen ergab eine konservierte asymmetrische Transkription der Gene der Nodal-Kaskade, während alle Gene, die im Bereich des Hühnerprimitivknotens asymmetrisch exprimiert werden, im Kaninchen wie in der Maus stets symmetrisch aktiv sind, u. a. fgf8 und shh. Ebenfalls im Gegensatz zum Huhn konnten Kaninchenembryonen erst nach Ausbildung des ersten Somitenpaares stabil in vitro kultiviert werden. Frühere Kulturen resultierten in bilateraler oder fehlender Expression asymmetrischer Marker. Zur Überprüfung der Tauglichkeit des Kaninchensystems wurden Aktivingetränkte Acrylkugeln in die rechte Seite kultivierter Embryonen plaziert. Aktivin, das wie Nodal wirkt, induzierte bilaterale Expression von nodal und Pitx2. Dieses Experiment zeigte, dass die Nodal-Kaskade im Kaninchen konserviert ist und dass die rechte Seite kompetent zur Induktion der Nodal-Kaskade ist. FGF8 hingegen hatte, im Gegensatz zur Situation in der Maus, keine induktive Wirkung. Im 1-3 Somitenstadium konnte auch keine repressive Funktion festgestellt werden. Allerdings fand sich eine strikte Korrelation zwischen der Plazierung der FGF8- Kugel und der Abwesenheit von nodal in früheren Stadien. Auch eine durch BMP4 ektopisch induzierte Expression der Nodal-Signalkaskade konnte durch gleichzeitige Applikation von FGF8 effizient reprimiert werden. Eine endogene rechts-asymmetrische Rolle von FGF8 konnte nach Unterdrückung der FGF8- Signalkaskade auf der rechten Seite früher Somitenstadien durch den Inhibitor SU5402 gezeigt werden. Dieses Experiment resultierte in bilateraler Expression von nodal und Pitx2. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Funktionsgewinnund -verlustexperimente weisen FGF8 im Kaninchenembryo eine rechtsasymmetrische Funktion zu. Sie zeigen, dass die unterschiedliche Wirkung in Huhn, Maus und Kaninchen nicht auf die asymmetrische Expression im Huhn und auch nicht auf eine Funktionsumkehr des FGF8 während der Evolution zwischen Vogel und Säuger zurückzuführen ist. Vielmehr deuten sie auf die spezifische Anatomie des Gastrula-/Neurulaembryos als eine zentrale Determinante der Links-Rechts-Achsenbildung hin.

Abstract
Most of the fundamental mechanisms of embryonic axis formation are conserved between the various classes of vertebrates, for example the BMP-signaling system and its antagonists in the formation of the dorsal-ventral axis. A marked exception is the growth factor FGF8, which plays opposite roles in the transfer of an not yet identified asymmetric signal from the midline domain to the periphery during the formation of left-right asymmetry in chick and mouse. In the chicken embryo fgf8 is expressed asymmetrically on the right side of the primitive node and inhibits the transcription of factors of the left signaling cascade, nodal, Pitx2 and lefty2 on the right side. In mouse, fgf8 is transcribed symmetrically. A hypomorphic allel and missexpression experiments in cultured mouse embryos assign FGF8 an instructive function in the induction of the Nodal signaling cascade on the left side. This discrepancy could be attributed to the different expression patterns, evolutionary differences and the architecture of the early embryo, which forms a flat blastodisc in chick, in contrast to a cylindrical socalled egg-cylinder in mouse. Thus in the present work the function of FGF8 was analysed in the rabbit embryo, which as a mammal develops via a blastodisc. Cloning and expression analysis of marker genes showed a conserved asymmetric expression of the nodal cascade genes, whereas all genes, which are asymmetrically expressed in or at the chicken primitive node, for example fgf8 and shh, are always symmetrically active both in rabbit and mouse. Likewise in contrary to the chick, stable in vitro culture of rabbit embryos was only possible after the formation of the first pair of somites. Earlier cultures resulted in bilateral or missing expression of asymmetric marker genes. In order to check the suitability of the rabbit system Activin-soaked acrylic beads were introduced into the right side of cultured embryos. Activin, which functions like Nodal, induced bilateral expression of nodal and Pitx2. This experiment showed that the Nodal cascade is conserved in the rabbit and that the right side is competent to induce the Nodal cascade. Whereas, unlike in mouse, FGF8 did not show an inducing effect. In stage 1-3 somite embryos FGF8 had also no repressive function. But a clear correlation between the placement of a FGF8 bead and absence of nodal transcription was observed in earlier stages. An ectopically induced expression of the Nodal signaling cascade by BMP4 could also be efficiently repressed by the parallel administration of FGF8. An endogenous right-asymmetric role of FGF8 could be shown by repressing the FGF8 signaling cascade on the right side of early somatic stages by the inhibitor SU5402. This experiment resulted in bilateral expression of nodal and Pitx2. Gain- and loss of function experiments presented in this work assign FGF8 a right-asymmetric function in the rabbit embryo. They show that the different effects in chick, mouse and rabbit cannot be attributed to the asymmetric expression in the chick and also not to a reversal of FGF8 function in the course of evolution birds to mammals. In fact they suggest that the specific anatomy of the gastrula/neurula embryo plays a pivotal determinant in left-right axis formation.

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