Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6803

Entwicklung und Anwendung von Isolierungs- und Quantifizierungsmethoden für epiphytische Mikroorganismen auf Blattoberflächen der Stieleiche (Quercus robur L.)

Thomas Heuser

Zusammenfassung
Epiphytische Mikroorganismen besiedeln Oberflächen von Pflanzen. Sie sind auf allen Pflanzen vorhanden und beeinflussen die Gesundheit ihres Wirts. Während einige Mikroorganismen nützlich für ihren Wirt sind, haben Andere schädliche Wirkung. Der Einfluß von epiphytischen Mikroorganismen auf ihren Wirt – positiv oder negativ – hängt oftmals von Umweltfaktoren ab. Obwohl Pflanzen und Mikroorganismen am gleichen Ort leben, kann eine Veränderung der Umweltbedingungen beide Partner unterschiedlich beeinflussen. Über epiphytische Mikroorganismen auf Blattoberflächen der Stieleiche (Quercus robur L.), einem wichtigen Baum deutscher Wälder, ist wenig bekannt. So ist der Mehltaubefall, verursacht von dem obligat parasitischen Pilz Microsphaera alphitoides, unter Eichen weit verbreitet aber schwer zu quantifizieren, da M. alphitoides nicht kultivierbar ist. Die bisherigen Methoden für die Quantifizierung epiphytischer Mikroorganismen auf Blattoberflächen der Stieleiche auf der Ebene von Zell- bzw. Kopienzahlen sind schlecht geeignet. Daher wurden zwei neue Quantifizierungsmethoden entwickelt. Die erste, eine auf der “leaf washing”-Technik basierende, mikrobiologische Methode, wurde zur Bestimmung der Gesamtzellzahl heterotropher Mikroorganismen sowie der Anteile von Bakterien, Pilzen und autotrophen Ammonium- und Nitritoxidierern genutzt. Eine zweite, molekularbiologische Methode wurde zur DNA-Isolation von epiphytischen Mikroorganismen von Blattoberflächen entwickelt. Durch PCR-Ansätze, welche die isolierte DNA und gattungsspezifische Oligonukleotide der “internal spacer region” von Prokaryoten [16S – 23S rDNA] bzw. der “intergenic spacer region” von Eukaryoten [18S – 28S rDNA] enthielten, war es möglich, sowohl die filamentösen Pilze Cladosporium spec., Microsphaera alphitoides und Ramularia spec. als auch das epiphytische Bakterium Erwinia spec. zu identifizieren. Ausgehend von diesen Sequenzen wurden Syber® Green Real Time PCR-Systeme zur Quantifizierung von DNA-Kopienzahlen dieser Organismen aufgebaut. Ein phylogenetischer Vergleich der sechs isolierten Sequenzen von Erwinia spec. führte so zur Identifizierung zweier Gruppen. Mit Hilfe von spezifischen TaqMan® Real Time PCR-Sonden wurde eine Differenzierung und Quantifizierung dieser beiden Gruppen ermöglicht. Von Frühling bis Herbst 2000 und 2001 wurden Eichen an zwei verschieden Standorten [Berg und Tal] unter verschiedenen UV-B Strahlungsniveaus kultiviert. Mit Hilfe der entwickelten Methoden wurden epiphytische Mikroorganismen auf den Blättern dieser Pflanzen quantifiziert. Mit Ausnahme der autotrophen Ammoniumoxidierer wurden alle beschriebenen Gruppen detektiert und ihre Zell- bzw. DNA-Kopienzahl monatlich bestimmt. Ein Vergleich von Zell- und Kopienzahlen epiphytischer Mikroorganismen auf Blattoberflächen von Eichen, welche mit und ohne UV-B Strahlung angezogen wurden, zeigte in den meisten Proben keine statistisch signifikanten Unterschiede. Daher kann ein drastischer Einfluß der UV-B Strahlung auf epiphytische Mikroorganismen ausgeschlossen werden. Die beobachtete hohe Variabilität zwischen verschiedenen Blattproben erlaubt zur Zeit keine weiteren Schlußfolgerungen zur Wirkung von UV-B Strahlung auf epiphytische Mikroorganismen. Weitere Untersuchungen mit einer deutlich erhöhten Probenanzahl sind daher zur Beantwortung dieser Fragestellung nötig. Im Gegensatz hierzu zeigte ein Standortwechsel der Versuchspflanzen deutlichere Effekte. Blätter von Eichen, welche im Tal angezogen und dann zum Bergstandort transportiert wurden, zeigten im Vergleich zu Pflanzen, die ausschließlich im Tal inkubiert wurden, eine statistisch signifikante bis höchst signifikante Verringerung der Gesamtzellzahl heterotropher Organismen sowie der Anteile von Pilzen. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß eine Veränderung der Umweltbedingungen, z.B. durch einen Standortwechsel, einen drastischen Einfluß auf die Zellzahl epiphytischer Mikroorganismen haben kann.

Development and Application of Isolation- and Quantification Methods for epiphytic Microorganisms on Leaf Surfaces of Pedunculate Oak (Quercus robur L.)

Abstract
Epiphytic microorganisms colonize the outer surfaces of plants. They are present on all plants and often influence the health of their host. While some microorganisms are beneficial to their hosts, others are pathogenic. The effect of epiphytic microorganisms on their host – positive or negative – often depends on environmental conditions. Though the plants and the microorganisms share the same space, a change in the environmental conditions may affect both partners in different ways. Less is known about epiphytic microorganisms on the leaves of pedunculate oak (Quercus robur L.), an important tree of German forests. Powdery mildew, caused by the obligate parasitic fungi Microsphaera alphitoides, occurs widely but is difficult to quantify, as M. alphitoides cannot be grown in culture. The existing methods are not well suited for the quantification of epiphytic microorganisms on leaves on the level of cell or DNA copy numbers. Therefore two new methods were developed for the quantification of epiphytic microorganisms on leaf surfaces of pedunculate oak. The first one, a microbiological method based on leaf washing, was used to determine cell numbers of total heterotrophic microorganisms, bacteria, fungi, autotrophic ammonium- and nitrite oxidizers. A second method, based on molecular biology, was developed for the isolation of DNA of epiphytic microorganisms on leaf surfaces. Using PCR samples containing the isolated DNA and genus specific oligonucleotides of the internal spacer region of prokaryotes [16S – 23S rDNA] and of the intergenic spacer region of eukaryotes [18S – 28S rDNA] it was possible to identify the filamentous fungi Cladosporium sp., Microsphaera alphitoides and Ramularia sp. as well as the epiphytic bacterium Erwinia sp.. Based on these sequences Syber® Green Real Time PCR systems were developed for quantification of copy numbers of those organisms. A phylogenetic comparison of six isolated sequences of Erwinia sp. led to the identification of two groups. Specific TaqMan® Real time PCR probes were designed, which were suitable for a differentiation and quantification of these two groups. From spring to autumn in 2000 and 2001 oaks were grown at two different locations [mountain and valley] under different UV-B levels. Epiphytic microorganisms living on leaves of the plants were quantified using the developed methods. Except for autotrophic ammonium oxidizers all described groups were detected and their cell and copy numbers were measured monthly. A comparison of cell and copy numbers of epiphytic microorganisms on oaks, which were grown with and without UV-B light, showed no significant difference [p > 0.05] in most samples. Therefore, a drastic influence of UV-B radiation on epiphytic microorganisms can be excluded. The observed high variability between leaves does not allow further conclusions concerning the effect of UV-B on epiphytic microorganisms at this point of time. Further research using a higher number of samples is needed to answer this question. Contrary to these results the effect of a change of location on epiphytic microorganisms showed more distinct results. Leaves of oaks, which were grown in the valley and then transferred to the mountain, showed a significant to highly significant decrease [p < 0.05 to p < 0.001] in numbers of fungi and total numbers of heterotrophic microorganisms compared to the number of microorganisms on the leaves of plants which were solely grown in the valley. These results clearly show that a change in environmental conditions, e.g. a change of location, may dramatically change the numbers of epiphytic microorganisms.

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