Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6806
Valproic Acid and
Peroxisome Proliferator-activated Receptor d Are Selective Modulators of a Histone Deacetylase with
Implication for the Transformed Phenotype of Colorectal Cancer Cells
Abstract
Valproic acid (VPA) has multiple
activities, e.g. it is an anti-epileptic drug, it is employed to treat bipolar
disorders, it induces birth defects and, in rare cases, it is toxic to the
liver. The different activities are likely to follow different mechanisms of
actions. Previous findings indicated that VPA and similar compounds that also
induce birth defects induce differentiation of F9 teratocarcinoma cells. This
differentiation-inducing activity is always associated with activation of
Peroxisome Proliferator-activated Receptor d- (PPARd)-dependent transcription. PPARd is a nuclear receptor proposed to play an important
role in colorectal tumorigenesis. The open questions to be addressed in this
thesis were by which mechanism VPA activates PPARd-dependent transcription, whether this mode of VPA
action has implications for the development of colonic cancer, and what could
be downstream targets regulated by PPARd.
The first major
finding of this study was that VPA is a subset-selective inhibitor of histone
deacetylases (HDACs) and, in addition, selectively reduces HDAC2 protein
levels. This finding was supported by observations from in vitro HDAC assays
and from investigations on HDAC expression upon VPA-treatment. At those VPA
concentrations that are employed also for therapy of epilepsy VPA
preferentially inhibits class I HDACs rather than class II enzymes. In addition
to the inhibition of enzymatic activity VPA selectively down-regulates HDAC2
protein levels by inducing ubiquitination and subsequent proteasomal
degradation. Since recruitment of corepressor-associated HDAC activities by
unliganded PPARd is
thought to be required for repression of PPARd-dependent gene expression, HDAC inhibition is the
most likely mechanism by which VPA activates PPARd-dependent transcription. More importantly, this
finding suggests a potential use of VPA in cancer therapy since inhibition of
HDACs is considered to be of therapeutic value in many forms of cancer.
The second
major finding was that HDAC2 activity is essential for the transformed
phenotype of colorectal cancer cells. This conclusion was mainly supported by
evidence from a colorectal cancer cell line that contains mutant form of the
tumor suppressor gene adenomatous polyposis coli (APC) and undergoes apoptosis
upon restoration of wild-type APC expression. In this cell line HDAC2
expression was found to be repressed by the presence of wild-type APC. Loss-of-function
and gain-of-function analyses indicated that HDAC2 is required and sufficient
for preventing apoptosis and maintaining the transformed phenotype of
colorectal cancer cells. Since elevated levels of HDAC2 were detected in many
samples of colorectal carcinomas, HDAC2 is likely also to play a role during
pathogenesis of colorectal cancer in vivo.
Finally, evidence
was obtained that PPARd regulates HDAC2 expression
either directly or indirectly in murine ES and F9 teratocarcinoma cells. Since
PPARd is negatively regulated by APC, this transcription factor may be one
of the links that mediates overexpression of HDAC2 upon loss of wild-type APC.
In summary,
this study revealed specific VPA-dependent repression of selected HDAC
activities, both, by inhibition of class I HDAC enzyme activities and targeted
degradation of HDAC2 protein. High levels of HDAC2 expression were found to be
essential for the transformed phenotype of colorectal cancer cells. Since HDAC2
expression itself might be induced by PPARd, and thus by VPA, this drug can be expected to have
several and partly opposite effects on HDAC2 abundance and activity in colonic
cancer cells. As assessed by cell survival and abundance of HDAC2 levels upon
VPA-treatment, induced degradation and inhibition of HDAC activity appear to
prevail over a putative induction of HDAC2 gene expression. Therefore VPA
appears to be suitable as a therapeutic agent in the therapy of colon cancer
patients.
Valproinsäure und Peroxisomenproliferator-aktivierter Rezeptor d sind selektive Modulatoren einer Histondeacetylase mit Auswirkungen auf
den transformierten Phänotyp colorektaler Krebszellen
Zusammenfassung
Das Antiepileptikum Valproinsäure (VPA) und seine
teratogenen Derivate induzieren einen spezifischen Typ der Differenzierung von
F9-Teratocarcinomzellen und aktivieren selektiv den
Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor delta (PPARd).
Bei PPARd,
dessen Expression durch die APC/b-Catenin-Signalkaskade
reguliert wird, handelt es sich um einen nukleären Rezeptor, von dem man
annimmt, dass er eine wichtige Rolle in der Entstehung colorektaler Tumore
spielt. Der Mechanismus, über den PPARd durch VPA
aktiviert wird, ist ebenso unbekannt wie die nachgeschalteten Ziele von PPARd
im Verlauf der colorektalen Karzinogenese.
Bei der Aufklärung des Mechanismus, welcher der
VPA-induzierten PPARd-Aktivierung zugrunde liegt, konnte
hier gezeigt werden, dass VPA in vitro HDAC-Aktivität hemmt. Im Gegensatz zu
Trichostatin A (TSA) jedoch, einem weiteren HDAC-Inhibitor, welcher Histondeacetylasen
der Klassen I und II im gleichen Ausmaß hemmt, inhibiert VPA präferenziell
Klasse I HDACs, während Klasse II-Enzyme bei den therapeutisch erreichten
Konzentrationen kaum beeinflußt werden. Zusätzlich zu dieser Selektivität der
direkten HDAC2-Inhibition verringert VPA im Gegensatz zu TSA auch noch die
Menge an HDAC2-Protein in den Zellen, jedoch nicht die der anderen Klasse
I-Enzyme wie HDAC1 und HDAC3. Dieser Effekt läßt sich auf einen durch
VPA-Behandlung selektiv verstärkten Abbau des HDAC2-Proteins über das
Ubiquitin-Proteasom-System und nicht auf transkriptionelle oder translationelle
Regulation zurückführen. Da HDAC-Inhibitoren potentielle Medikamente für die
Krebstherapie sind, könnte diese Isoenzymselektivität ein Vorteil für die klinische
Anwendung von VPA als Krebsmedikament sein.
In dieser Studie wird gezeigt, dass PPARd-defiziente F9-Zellen und PPARd+/- ES-Zellen deutlich geringere Mengen an Histondeacetylase 2 (HDAC2) exprimieren, sowohl auf mRNA- wie auch auf Proteinebene. Überexpression von PPARd induziert HDAC2-Expression in F9-Zellen. Dabei kann es sich jedoch nicht um eine Liganden-induzierte Aktivierung des Rezeptors handeln, da der PPARd-Ligand pGl weder in F9-Zellen noch in der humanen colorektalen Krebszell-Linie HT-29 die HDAC2-Expression verstärkt. Demnach wird HDAC2 offensichtlich durch PPARd reguliert, wenn auch der exakte Mechanismus der Regulation unklar bleibt.
Histondeacetylasen spielen eine wichtige Rolle in der
Transkriptionsregulation und in der Pathogenese bei Krebs. So ist zum Beispiel
die aberrante Rekrutierung von HDAC-Aktivität entscheidend an der Pathogenese
einiger Leukämieformen beteiligt. Die Regulation der HDAC2-Expression durch
PPARd
deutete darauf hin, dass HDAC2 eine Rolle bei der Pathogenese von Dickdarmkrebs
spielen könnte. Die Expression von funktionellem Wildtyp-APC-Tumorsuppressorgen
vermindert die HDAC2-Expression in HT-29-Zellen. Andererseits ist HDAC2 im
Gewebe colorektaler Karzinome im Vergleich zu normalem Gewebe der gleichen
Patienten überexprimiert. Wird die HDAC2-Expression durch RNAi-Technik
unterdrückt, führt das zu einem beträchtlichen Wachstumsarrest in HT-29-Zellen.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Verringerung der HDAC2-Aktivität die
Apoptose in HT-29-Zellen erheblich verstärkt, in geringerem Maße deren
Differenzierung induziert, jedoch nicht den Verlauf des Zellzyklus beeinflußt.
In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen antagonisiert die ektopische
Expression von HDAC2 die APC-induzierte Apoptose in HT-29-Zellen. Insgesamt
zeigen diese Beobachtungen, dass HDAC2 eine wichtige Rolle bei dem
transformierten Phänotyp colorektaler Krebszellen spielt.
Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass aberrante
HDAC2-Expression, die durch PPARd reguliert
sein könnte, für den transformierten und tumorigenen Phänotyp colorektaler
Krebszellen wichtig ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass VPA ein
selektiver HDAC-Inhibitor ist, der präferenziell Klasse I-Enzyme hemmt und
gleichzeitig HDAC2 selektiv für den Ubiquitin-Proteasom-vermittelten
Proteinabbau markiert. Die angedeutete Rolle, die HDAC2 für die Karzinogenese
spielen könnte, zusammen mit dem selektiven inhibitorischen Potential von VPA
für Klasse I-HDACs, insbesondere HDAC2, deutet auf eine mögliche Anwendung von
VPA bei der Therapie von Patienten mit Dickdarmkrebs hin.