Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6824

Studies on the role of Nur77 nuclear orphan receptors and Rel/NF-kB transcription factors in T cell receptor-mediated apoptosis.

Michal Malewicz

Abstract
The Activation Induced Cell Death (AICD) is a process in which T cell receptor (TCR) induces apoptosis in activated T cells in the peripheral lymphoid system. AICD serves to remove potentially harmful self-reactive T cells and to limit T cell expansion during an immune response. AICD operates in a strictly clone specific fashion where cells stimulated through TCR, but not bystander cells, undergo apoptosis. Defective AICD is a cause of autoimmune syndromes and the understanding of the molecular mechanisms of TCR-mediated apoptosis is therefore of great medical importance. The Nur77 nuclear orphan receptor and Rel/NF-kB proteins are two families of transcription factors, which are involved in TCR-mediated cell death. Molecular mechanisms, by which these proteins contribute to AICD remain, however, obscure. In the work presented here the function of Nur77 nuclear orphan receptors and Rel/NF-kB proteins in TCR-mediated apoptosis was studied by the application of in vitro models of AICD.

It has been previously reported in the literature that Nur77 promotes AICD. In addition, published experiments with prostate cancer cells revealed that Nur77 translocates to mitochondria to induce apoptosis.

In this work it was shown that in T cell hybridoma Nur77 induction by TCR was prolonged and correlated with apoptosis. However, Nur77 overexpression alone did not result in apoptosis. Furthermore, Nur77 was found in the nucleus of TCR stimulated T cell hybridoma cells and TCR-mediated apoptosis was insensitive to the action of anti-apoptotic protein Bcl2 arguing against the involvement of mitochondria in this cell system. Both findings suggest that in T cells Nur77 executes its pro-apoptotic activities through gene regulation.

Conditional expression of Nur77 in Jurkat T cells was therefore used to identify genes, which respond to Nur77 activation. Out of 8000 genes tested only 5 shown reproducible up-regulation by Nur77. Among those were α-enolase and VIP genes known to regulate apoptosis and T cell development, respectively. These data validate the suitability of gain-of-function approaches to characterise Nur77 target genes and pave the way to a better understanding of Nur77 function.

Previous studies on NF-kB function in TCR-induced apoptosis revealed either anti- or pro-apoptotic role for NF-kB depending on the AICD model used.

In the T cell hybridoma model of AICD TCR strongly induced NF-kB and inhibition of NF-kB resulted in increased sensitivity to TCR-mediated apoptosis. This correlated with a lack of induction of the anti-apoptotic A20 cytoplasmic zinc finger protein, a well-known inhibitor of TNF-induced apoptosis. Strikingly, NF-kB -deficient hybridoma cells showed TNF-dependent death rather than normal Fas-dependent AICD. In addition, in the absence of NF-kB, TNF induced bystander apoptosis demonstrating that AICD lost its clonal specificity. Introduction of an A20 transgene into NF-kB-negative T cell hybridoma cells completely reversed the phenotype. These data indicate that NF-kB plays both anti- and pro-apoptotic roles during AICD via the expression of A20. In addition, NF-kB enables cells to maintain clonal specificity of AICD by controlling the balance between Fas and TNF cell death pathways.

Together the data presented in this work increase the understanding of the molecular mechanisms underlying the process of T cell receptor induced cell death.

Untersuchungen zur Rolle der Nur77 Orphan-Receptoren und der Rel/NF-kB Transcriptionsfactoren bei der T-Zellreceptor-vermittelten Apoptose.

Zusammenfassung
Beim sogenannten Aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD) induziert der T-Zellrezeptor (TZR) Apoptose in aktivierten T-Zellen des peripheren lymphoiden Systems. AICD eliminiert so die potenziel schadenden selbst-reaktiven T-Zellen und verhindert eine unlimitierte Expansion der T-Zellen während einer Immunantwort. AICD wirkt in einer klonal-spezifischen Weise in der nur die TZR aktivierten T-Zellen sterben. Ein defekter AICD ist eine der möglichen Ursachen von Autoimmunerkrankungen. Ein Verständnis der molekularen Mechanismen der TZR-vermittelten Apoptose ist daher von großer medizinischer Bedeutung. Das Nur77 Protein, ein Mitglied der Steroidhormonrezeptorfamilie für das bisher noch kein Ligand identifiziert wurde, und die Rel/NF-kB Proteine sind Transkriptionsfaktoren, für die eine Rolle beim TZR-vermittelten programmierten Zelltod gezeigt werden konnte. Da die genauen molekularen Mechanismen allerdings noch weitgehend unbekannt sind, wurde in dieser Arbeit die Funktion von Nur77 und NF-kB beim AICD in einem Zellkulturmodell genauer untersucht.

Es war vorher veröffentlicht, daß Nur77 eine positive Rolle bei AICD spielt. Zusätzlich, wurde es gezeigt, daß in Prostata-Krebs-Zelllinie Nur77 die Apoptose direkt durch Bindung an Mitochondrien induzieren kann.

In dieser Dissertation konnte es gezeigt werden, daß die Aktivierung des TZR in T-Zellhybridomen eine starke und anhaltende Expression von Nur77 bewirkt, was gut mit der Induktion von Apoptose korrelierte. Die Stimulierung des TZR führte zu einer quantitativen Translokation von Nur77 in den Zellkern und der TZR-vermittelte Zelltod konnte nicht durch das anti-apoptotische Bcl-2 Protein blockiert werden. Diese Daten legen daher nahe, daß Nur77 die Expression von Genen reguliert, die an der TZR-vermittelten Apoptose beteiligt sind, auch wenn die Überexpression von Nur77 alleine nicht ausreichte, um in diesem System Apoptose auszulösen.

Um mögliche Nur77 Zielgene zu identifizieren wurde ein System etabliert, in dem Nur77 spezifisch aktiviert werden konnte. Von insgesamt 8000 untersuchten Genen zeigten lediglich fünf eine reproduzierbare durch Nur77 vermittelte Induktion. Für zwei dieser Gene, Enolase-α und vasoactive intestinal peptide (VIP), war bereits eine Rolle bei der Regulation von Apoptose bzw. bei der T-Zellentwicklung beschrieben worden. Mit diesem experimentellen Ansatz können demnach potentielle Nur77 Zielgene isoliert werden, was zu einem besseren Verständnis der Nur77 Funktion beitragen sollte.

Abhängig vom Modell-System zeigten die vorher publizierten Ergebnisse entweder eine anti- oder pro-apoptotische Funktion der Rel/NF-kB Proteine in AICD.

In dieser Dissertation führte die Aktivierung des TZR in dem T-Zellhybridom Modell des AICD zu einer starken NF-kB Induktion. Gleichzeitig resultierte die Blockierung von NF-kB in einer erhöhten Sensitivität der Zellen gegenüber AICD was mit einer defekten Expression des anti-apoptotischen NF-kB Zielgenes A20 koreliierte. Interessanterweise wurde der Zelltod in NF-kB -defizienten Zellen durch den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und nicht durch den FasL/Fas Signalweg vermittelt. Es hat sich auch herausgestellt, daß TNF in der Abwesenheit von NF-kB die unstimulierten T-Zellen in trans tötet und deshalb die physiologische Regulation der AICD blockiert. Durch Rekonstitutionsexperimente konnte schließlich nachgewiesen werden, daß A20 hinreichend ist, um den TZR-vermittelten Zelltod in NF-kB -defizienten Zellen wieder auf das normale Maß zu reduzieren. Ektopisch exprimierte A20 konnte der TNF-Signalweg blockieren und gleichzeitig auch den Fas-abhängigen Zelltod in NF-kB -defizienten Zellen wiederherstellen. Diese Befunde zeigen, daß NF-kB in diesem Modell des AICD sowohl anti- als auch pro-apoptotische Funktionen ausübt. Demnach kontrolliert NF-kB durch die Expression seines Zielgenes A20 die Balance zwischen Fas- und TNF-vermitteltem programmiertem Zelltod, was zur Erhaltung der klonalen Spezifität des AICD beiträgt.

In Zusammenfassung die in dieser Dissertation erhaltene Ergebnissen führen zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der TZR-vermitteltem programmiertem Zelltodes.

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