Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6855

Charakterisierung des Transkriptionsfaktors SIX2 und seiner Bindungsstellen im GDNF- und Six2-Promotor

Stephan Brodbeck

Zusammenfassung
Die frühe Nierenentwicklung in Säugern stellt ein klassisches Modell der Organogenese dar. Obwohl viel über die morphogenetischen Prozesse während dieses Stadiums der Entwicklung bekannt ist, sind die molekularen Mechanismen der Nephrogenese noch weitestgehend unverstanden. Einer der Schlüsselfaktoren in der frühen Nierenentwicklung ist GDNF, das Protein des Genes glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF). Dieses Protein wird vom metanephrischen Mesenchym sekretiert und bindet an den Wolffschen Gang, wo es dessen Knospung und somit die weitere Nierenentwicklung induziert. Die Regulation der Expression von GDNF ist noch nicht bekannt. Knock-out Studien von Genen, die im metanephrischen Mesenchym während des gleichen Zeitraumes exprimiert werden wie GDNF, liefern zumindest Hinweise auf die Faktoren, die für die Regulation der Expression von GDNF notwendig sind. Zu diesen Faktoren gehören Pax2, Six2 und Eya1. Die Beteiligung dieser Gene, bzw. ihrer Genprodukte, legt ein regulatorisches Netzwerk während der frühen Nierenentwicklung nahe, wie dies für Mitglieder dieser Genfamilien in der Entwicklung anderer Organe schon gezeigt wurde. Auch über die Regulation der Expression der Gene Pax2, Six2 und Eya1 ist nur wenig bekannt.

Ein Ziel dieser Arbeit war es, Faktoren zu identifizieren, die direkt an der Expression von GDNF beteiligt sind. Ein direkter Effekt der Proteine von Pax2, Six2, Eya1 auf ein GDNF-Promotor-Fragment sollte mit Hilfe von transienten Transfektionen nachgewiesen werden. Da nur bei SIX2 ein Effekt auf die Transaktivierung beobachtet wurde, erfolgte eine weitere Charakterisierung von zwei Bindungsstellen von SIX2 im GDNF-Promotor durch Gelretardations- und Footprintanalysen. Aufgrund eines vermuteten regulatorischen Pax2-Eya1-Six2-GNDF Pfades sollte auch die Regulation der Expression von Six2 untersucht werden. Da der murine Six2-Promotor noch nicht charakterisiert wurde, klonierte ich ein 920bp Fragment des Promotors aus einer cDNA-Bibliothek, welches anschließend auf eine Transaktivierung und Bindung durch genau die gleichen Gene untersucht wurde, wie sie beim GDNF-Promotor benutzt wurden. Dabei wurde festgestellt, dass SIX2 seinen eigenen Promotor aktivieren kann und dies ähnlich wie beim GDNF-Promotor über zwei Bindungsstellen geschieht. Beide gefundenen Bindungsstellenpaare enthalten palindrome Sequenzen. Eine in vivo Aktivität der verwendeten Promotorfragmente konnte durch Herstellung transgener Mäuse nachgewiesen werden. Bei diesen Mäusen ist eine Expression eines Reporters, der unter der Kontrolle der jeweiligen Promotorfragmente steht, in den Geweben zu beobachten, in denen sich auch in Wildtyp-Mäusen eine Expression von GDNF, bzw. Six2 findet.

Eine Funktion von SIX2 als Transkriptionsfaktor ist bisher noch nicht eindeutig belegt worden. In dieser Arbeit gelang es nachzuweisen, dass im C-Terminus des SIX2-Proteines eine Transaktivierungsdomäne lokalisiert ist. Auch konnte gezeigt werden, dass andere Six-Familienmitglieder dazu in der Lage sind, den Six2-Promotor zu aktivieren und eine Interaktion mit Pax-Familienmitgliedern wahrscheinlich ist.

Characterisation of the transcription factor SIX2 an his binding sites in the GDNF- and Six2-promoter

Abstract
Early kidney development in mammals is a classical model of organogenesis. Although morphogenetical processes are well characterised during this time, not much is known about the genetical mechanisms of nephrogenesis. One important factor involved in this process is the protein of glial cell line derived neurotrophic factor gene, (GDNF), which is secreted from the metanephric mesenchyme. GDNF binds to the nephric duct, where it initiates the formation of the uretric bud and kidney development can continue. Many of the factors that regulate the expression of GDNF are still unknown. Knock out experiments of genes, which are expressed in metanephric mesenchyme during the stages of development when GDNF is expressed give some hint in respect of the factors, that could be involved in regulation of GDNF. Some of this factors include Pax2, Six2 and Eya1. The fact, that these genes are involved in regulation of GDNF leads to the establishment of a possible regulatory network during kidney development, since other members of these gene families are known to act in such way during development of other organs. The regulation of expression of Pax2, Six2 and Eya1 is also mostly unknown.

One aim of this work was to identify factors, that are directly involved in regulation of the expression of GDNF. Such a direct effect of PAX2, SIX2, EYA1 and WT1 on the GDNF-promoter can be characterised by transient transfection assays. Only SIX2 has shown an effect on the promoter fragment used and two binding sites of SIX2 have been identified by electromobility shift assays and footprint assays. In accordance with a regulatory model containing Pax2-Eya1-Six2-GDNF pathway, factors, that are necessary for expression of Six2 were characterised. I cloned a 920 bp fragment of the murine Six2-promoter and examined possible transactivation effects and binding abilities with the same genes used in the GDNF promoter studies. I have found, that SIX2 activates its own promoter and similarly to the GDNF-promoter, there are two binding sites of SIX2 in the Six2-promoter. Both pairs of binding sites contain palindrome sequences. To show an in vivo activity of the used promoter fragments, transgenic mice were generated. Expression of a reporter gene, under the control of the Six2- or GDNF promoter fragments in transgenic mice, was found in tissues, where endogenous expression of Six2 or GDNF in wildtype mice is also seen.

The function of SIX2 as transcription factor is not well characterised. In this study I demonstrate that the C-teminus of SIX2 contains a transactivation domain. I also showed, that SIX3 and SIX6 also have an effect on the Six2-promoter and that these members of the Six-family can interact with members of the Pax-gene family.

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