Wissenschaftliche Berichte

Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6878

Subunit Selectivity of the Crosstalk between GR and AP-1

R. Ünal

Abstract
It has been reported that AP-1 plays important roles in cellular growth, differentiation, tumor formation and development. AP-1 consists of several proteins associating as dimers. There is a high heterogeneity in dimer composition of the AP-1 complex which is caused by the fact that multiple AP-1 subunits can be expressed at the same time. The AP-1 transcription complex is composed of the members of the Jun (c-Jun, JunB and Jun D), Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra2) and CREB/ATF families. MAPK pathways regulate both the amounts and transactivating capacities of the Jun, Fos and ATF-2 proteins in a stimulus specific manner: treatment of fibroblasts with PDGF, serum or phorbol esters predominantly activates the Extracellular-Regulated Kinase (ERK) members of the MAPK family, which leads to strong stimulation of Jun/Fos activity via de novo synthesis of c-Jun/c-Fos, Jun B/c-Fos, and Jun B/Fos B. Treatment of the same cells with stress-inducing stimuli like ultraviolet light or alkylating agents predominantly activates the Jun N-terminal Kinase (JNK)/Stress Activated Protein Kinase (SAPK) members of the MAPK family which preferentially, enhance Jun/ATF-activity. Depending on the composition of the dimer, different sequence elements are preferentially recognized. Jun/Fos dimers bind to heptameric AP-1 binding sites while Jun/ATF dimers bind octameric AP-1 binding sites.

Glucocorticoids (GC) are widely used as anti-inflammatory and immunosuppressive drugs. Glucocorticoid hormones are involved in the regulation of many physiological processes. The effect of glucocorticoids in the cell is transmitted through its receptor, the glucocorticod receptor (GR). It is reported that the interaction between GR and AP-1 results in the inhibition of AP-1 mediated transcription by GR.

One of the aims in this project was to generate transgenic mice, predominantly carrying c-Jun with altered dimerization specificities where c-Jun dimerizes with c-Fos or ATF-2. Throughout the course of this work only chimaeric animals which would enable to get homozygous transgenic mice, were obtained. Phenotypical and histological analysis would be performed with transgenic mice in order characterize the differences between the mutated and wild type mice.

On the other hand a cell culture model, which already was established by the stable transfection of fibroblasts with c-Fos favouring c-Jun (m0) or ATF-2 favouring c-Jun (m0.1) mutant constructs, was used in order to address which of the above mentioned dimers participate in the inhibition of GR mediated AP-1 transcriptional activity. This work shows that TPA stimulation but not UVC stimulation of m0-fibroblasts transcriptionally activates Fra-1 which is an AP-1 target gene. The experiments where the fibroblasts are stimulated with glucocorticoids and adenoviral E1A are currently in progress.

Zusammenfassung
Activating Protein 1 (AP-1) ist ein Transkriptionsfaktor, dem eine wesentliche Bedeutung im Hinblick auf Zellwachstum, Differenzierung, Tumorenstehung und Entwicklung nachgewiesen wurde. Er besteht aus mehreren Proteinen und gehört zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die ihre Funktion mittels Dimerisierung ausübt. Die Heterogenität der Dimerkomposition im AP-1 Komplex ist hoch, was auf die Exprimierung verschiedener AP-1 Untereinheiten zur gleichen Zeit zurückzuführen ist. AP-1 besteht aus den Mitgliedern der Jun (c-Jun, JunB and Jun D), der Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra2) und der CREB/ATF Familie. Die Signalkaskade mittels der mitogen aktivierten Proteinkinase MAPK (engl. Mitogen Activated Protein Kinase) reguliert das Ausmaß der Transaktivierung durch Jun, Fos und ATF-2 in einer stimulusspezifischen Weise. Die Behandlung der Fibroblasten beispielsweise mit dem Wachstumsfaktor „Platelet derived growth factor“ (PDGF), mit Serum, welches ebenfalls Wachstumsfaktoren enthält, oder dem Phorbolester TPA aktiviert bevorzugt die extrazellulär regulierten Kinasen der MAPK-Familie, die die Jun/Fos Aktivität in hohem Maße stimuliert. Die Behandlung der gleichen Zellen mit Stress induzierenden Stimuli wie mit Ultraviolettbestrahlung (UVC) oder alkylierenden Agenzien führt hingegen vornehmlich zur Aktivierung der Kaskade, die durch die Mitglieder der Jun N-terminalen Kinase (JNK)/Stress-aktivierte Proteinkinase (SAPK) der MAPK-Familie vertreten sind, die schließlich den Jun/ATF-Komplex heraufreguliert. Abhängig von der Dimerkomposition binden verschiedene AP-1-Dimere an unterschiedlichen AP-1-Bindestellen. Die Bindung von Jun/Fos erfolgt beispielsweise bevorzugt an heptamerischen und jene von Jun/ATF-2 an oktamerischen AP-1-Bindestellen.

Glukokortikoide (GK) finden aufgrund ihrer antiinflammatorischen und immunsuppressiven Wirkung eine breite therapeutische Anwendung. Sie sind an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Der Einfluss der Glukokortikoide in der Zelle wird durch ihre Rezeptorbindung an den Glukokortikoidrezeptor (GR) vermittelt. Studien bezüglich der Interaktion zwischen AP-1 und GR haben herausgestellt, dass die Transkription der Zielgene von AP-1 durch die GR-Aktivität gehemmt wird. Die vorliegende Arbeit verfolgte zum einen das Ziel, transgene Mausmodelle zu etablieren, in welchem Zielzellen entweder bevorzugt die Dimerisierung von c-Jun-Proteinen mit c-Fos-Proteinen oder mit ATF-2-Proteinen aufweisen. Bisher konnten chimäre Mauslinien etabliert werden, deren Verpaarung zur Herstellung homozygot transgener Mäuse führen wird. Diese werden dann einer phenotypischen und histologischen Analyse unterzogen, um mögliche Abweichungen in den mutanten Mäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen zu charakterisieren. Zum anderen wurde ein bereits etabliertes Zellkulturmodell in stabil transfizierten Fibroblasten herangezogen, um mehr Aufschluss darüber zu bekommen, ob die c-Jun/c-Fos-Dimere (m0-Zelllinie) oder die c-Jun/ATF2-Dimere (m0.1-Zelllinie) an der GR-mediierten Hemmung der Transkription der Zielgene von AP-1 beteiligt sind. Im ersten Schritt konnte gezeigt werden, dass die TPA-Stimulierung der m0-Fibroblasten die Zunahme der Transkription des AP-1-Zielgens Fra-I zur Folge hatte, wohingegen die UVC-Behandlung gar keine Fra-I-Transkription indizierte. Die Stimulierung der beiden Fibroblastenzelllinien mit GK und adenoviral E1A wird derzeit durchgeführt.

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