Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 6971
Nachweis, Lokalisation und Quantifizierung von autotrophen Nitrifizierern im Kronenraum der Fichte (Picea abies (L.) Karst.)
Die Gruppe der chemolithoautotrophen Nitrifizierer umfaßt
Gram-negative, licht- und säure-empfindliche, obligat aerobe Bakterien, die
ihren Zellkohlenstoff durch die Fixierung von Koh-lendioxid und die hierfür
notwendige Energie aus der Oxidation anorganischer Stickstoffverbin-dungen,
insbesondere Ammoniak und Nitrit, gewinnen. Als bisherige Lebensräume wurden
die Pedo-, Hydro-, Litho- und Phyllosphäre identifiziert. Im Rahmen dieser
Arbeit gelang es durch den Einsatz modernster molekularbiologischer Techniken
erstmalig auf genetischer Ebene, die autotrophen Nitrifizierer unmittelbar im
Nadelblatt-Apoplasten von Fichten des durch hohe atmogene Stickstoffeinträge
belasteten Standortes „Höglwald“ direkt nachzuweisen und zu loka-lisieren.
Durch den Einsatz der hochspezifischen PCR-Technik in Verbindung mit der
Sequen-zierung des genetischen Materials aus dem Kronenbereich der Fichten
konnten die Nitrifizierer genetisch direkt nachgewiesen und klassifiziert
werden. Die exakte Lokalisation der autotrophen Nitrifizierer unmittelbar im
Fichtennadel-Apoplasten gelang, ebenfalls auf genetischer Ebene, weltweit
erstmalig mit Hilfe der molekularbiologischen Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs-Technik
in Kombination mit der Auswertung über das konfokale Laserrastermikroskop
(cLSM). Anhand der Quantifizierung der autotrophen Nitrifizierer über die
klassische, mikrobiologische Bestimmung der höchstwahrscheinlichen Keimzahl,
der sog. „Most Probable Number“-Technik (MPN-Technik), konnten
Ammoniak-Oxidierer in einer Größenordnung von 10 3-5 Zellen g-1
Nadelfrischgewicht und Nitrit-Oxidierer mit 10 3-4 Zellen g-1
Nadelfrischgewicht am Standort „Höglwald“ nachgewiesen werden. An einem
durch Stickstofflimitierung gekennzeichneten Fichtenstandort bei Villingen
wurden in vergleichenden Untersuchungen autotrophe Nitrifizierer zu keinem
Zeitpunkt nachgewiesen, was darauf schließen läßt, daß die Besiedlung der
Fichten-phyllosphäre, insbesondere des Nadelblatt-Apoplasten, durch autotrophe
Nitrifizierer an die Stickstoffbelastung der Umgebung gekoppelt sein muß. Eine
saisonale Veränderung der Besied-lung des Nadelblatt-Apoplasten durch
Nitrifizierer am Standort „Höglwald“ konnte nicht be-obachtet werden. Um erste
Hinweise über den eigentlichen Besiedlungsweg zu erhalten, wurden im Labor
unter sterilen Bedingungen sowohl mit Ammoniak als auch mit Luft begaste
sterile Fichtenkeimlinge mit autotrophen Nitrifizierer-Kulturen inokuliert.
Eine erfolgreiche Etablierung autotropher Nitrifizierer in der Phyllosphäre der
Fichtenkeimlinge gelang nicht bei einmaliger, wohl aber nach wiederholter
Inokulation.
Detection,
localisation and quantification of autotrophic nitrifiers within the canopy of
spruce (Picea abies (L.) Karst.)
Abstract
The group of
chemolithoautotrophic nitrifiers contains Gram-negative, light and acid
sensitive, obligate aerobic bacteria, which use carbon dioxide-fixation for
gaining cell carbon and use oxidation of inorganic nitrogen compounds,
especially ammonia and nitrite, as energy sources. Hitherto identified habitats
for nitrifiers were the pedo-, hydro-, litho- and phyllosphere. In this work,
by application of the most advanced molecular biological methods it could be
unequivocally demonstrated at the genetic level for the first time that
autotrophic nitrifiers are present inside spruce needles of a spruce forest
ecosystem (The “Höglwald”) which is exposed to high levels of atmospheric
nitrogen deposition and that they are located within the apoplastic space of
the needle leaves (sub-stomatal cavity). By application of the highly specific
PCR-technique in conjunction with the sequencing of the genetic material from
the canopy of spruce the nitrifiers could be directly genetically verified and
classified. The exact localisation of the autotrophic nitrifiers directly
within the apoplast of spruce needles at the genetic level succeeded for the
first time via the combination of both, the molecular biological flourescence-in
situ-hybridization-technique with the modern technique of confocal laser
scanning microscopy (cLSM). Quantification of cell numbers of autotrophic
nitrifiers was carried out using the „Most Propable Number“ (MPN)-technique. At
the „Höglwald“ experimental site ammonia-oxidizers were founded with 10 3-5
cells g-1 needle freshweight and nitrite-oxidizers with 10 3-4
cells g-1 needle freshweight. In contrast, at a spruce forest
site (near the city of Villingen), which is exposed to low levels of
atmospheric nitrogen deposition, nitrifiers were never detected. It is
concluded that the colonization of the needle apoplast by autotrophic
nitrifiers is related to elevated levels of atmospheric N-deposition the
Höglwald experimental site is exposed to. A seasonal pattern of the
colonization of the needles by nitrifiers at the „Höglwald“ could not be demonstrated
to exist. For gaining first insights into the pathway by which needles might be
colonized by autotrophic nitrifiers, sterile spruce seedlings, fumigated with
both ammonia and air, were inoculated in the laboratory with nitrifier
cultures. However, a succesful establishment of the autotrophic nitrifiers in
the phyllosphere of the spruce seedlings could not be achieved by a single
inoculation event, however was successful after multiple inoculations.