Forschungszentrum
Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte – FZKA 7017
Activation of the tumor
suppressor merlin by myosin/moesin phosphatase
Hongchuan Jin
Abstract
One of the most
important characteristics of normal cells as compared to cancer cells is the
inhibition of growth upon cell-cell contact. The tumor suppressor merlin plays
a critical role in the establishment and maintenance of this contact
inhibition. Merlin becomes active at high cell density and mediates contact
inhibition by interfering with the transduction of Ras dependent proliferation
signals. This growth inhibiting ability of merlin is associated with its
dephosphorylation at serine 518. When merlin is phosphorylated by PAK-2 or PKA
at this site, it cannot inhibit cell growth.
In order to identify the activating
phosphatase of merlin, RT4 cells were engineered to express C-terminal merlin
(C-merlin, 300-595). This C-terminal part of merlin contains the critical
serine 518 site and is regulated similarly to full-length merlin in these
cells. At first, PP1 rather than PP2A was identified as the catalytic subunit
of the phosphatase, since the dephosphorylation of merlin was inhibited only by
high concentrations of okadaic acid and purified PP1 could dephosphorylate
C-merlin in vitro more efficiently than PP2A. Myosin/moesin phosphatase
consisting of PP1δ as the catalytic subunit and MYPT-1 as the target
subunit was then identified as the phosphatase of merlin. i) Merlin interacted
directly with MYPT-1 both in vivo and in vitro. This direct interaction was
mediated by a region from residue 312 to 341 in merlin and the leucine zipper
domain in MYPT-1. ii) A naturally occurring mutation of the nf-2 gene (L339F)
in this interacting region could impair the interaction of merlin with MYPT-1.
iii) Under conditions when merlin was dephosphorylated, this phosphatase was
activated via its dephosphorylation at threonine 696. iv) Furthermore, merlin
could not be dephosphorylated and lost its growth inhibitory ability in the
presence of CPI-17, a specific inhibitor of myosin/moesin phosphatase. Finally,
CPI-17 was able to induce transformation by inhibiting the activation of merlin
and is therefore proposed to be a novel oncoprotein.
In conclusion, this study reveals
that myosin/moesin phosphatase is the activating phosphatase of merlin and
plays a central role in mediating contact inhibition.
Aktivierung des Tumorsuppressor-Proteins Merlin durch
Myosin/Moesin Phosphatase
Zusammenfassung
Eine der wichtigsten
Eigenschaften von normalen Zellen im Unterschied zu Krebszellen besteht in der
Hemmung des Wachstums unter Zell-Zell-Kontakt Bedingungen. Das
Tumorsuppressor-Protein Merlin spielt in der Etablierung und Aufrechterhaltung
dieser Kontaktinhibition eine entscheidende Rolle. Merlin wird bei Erreichen
einer hohen Zelldichte aktiviert und vermittelt die Kontaktinhibition, indem
Ras-abhänginge Proliferationssignale gehemmt werden. Diese
wachstums-inhibitorische Fähigkeit Merlins ist mit seiner Dephosphorylierung am
Serinrest 518 verbunden. Erfolgt durch die Kinasen PAK-2 oder PKA eine
Phosphorylierung an dieser Stelle kann Merlin das Zellwachstum nicht mehr
inhibieren.
Um die Merlin-aktivierende
Phosphatase zu identifizieren, wurden RT4 Zellen verwendet, die den C-Terminus
von Merlin (C-Merlin, 300-595) künstlich überexprimieren können. Der C-Terminus
enthält den kritischen Serinrest 518 und wird in diesen Zellen ähnlich dem
vollständigen Merlin reguliert. Die Dephosphorylierung von Merlin konnte erst
durch hohe Konzentrationen Okadainsäure inhibiert werden, welches eher auf PP1
als auf PP2A als katalytische Untereinheit schließen ließ. Weiterhin konnte
C-Merlin in vitro durch aufgereinigte PP1 effizienter dephosphoryliert werden
als durch PP2A. Die Myosin/Moesin Phosphatase, welche aus PP1 als
katalytischer und aus MYPT-1 als regulatorischer Untereinheit besteht, wurde
dann als Phosphatase von Merlin identifiziert. i) Merlin interagierte in vitro
und in vivo direkt mit MYPT-1. Diese direkte Interaktion wird in Merlin durch
die Aminosäuren 312 bis 341 und in MYPT-1 durch die Leucinreißverschluss-Domäne
vermittelt. ii) Eine natürlich vorkommende inaktivierende Mutation des nf-2
Gens (L339F) in dieser Interaktionsregion verhindert die Bindung von MYPT-1 an
Merlin. iii) Unter Bedingungen, unter denen Merlin dephosphoryliert ist, ist
die Myosin/Moesin Phosphatase durch Dephosphorylierung am Threonin 696
ebenfalls aktiviert. iv) Schließlich konnte gezeigt werden, daß Merlin in
Gegenwart von CPI-17, einem spezifischen Myosin/Moesin Phosphatase Inhibitor,
nicht mehr dephosphoryliert werden und als Tumorsuppressor wirken kann.
Konsequenterweise induziert CPI-17 durch Inhibition der Merlinaktivierung
Transformation von Zellen und wird daher als neues Onkoprotein vorgeschlagen.
Diese Studie zeigt, daß die
Myosin/Moesin Phosphatase die Merlin-aktivierende Phosphatase ist und eine
zentrale Rolle in der Vermittlung der Kontaktinhibition spielt.
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