Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte – FZKA 7017

Activation of the tumor suppressor merlin by myosin/moesin phosphatase

Hongchuan Jin

Abstract
One of the most important characteristics of normal cells as compared to cancer cells is the inhibition of growth upon cell-cell contact. The tumor suppressor merlin plays a critical role in the establishment and maintenance of this contact inhibition. Merlin becomes active at high cell density and mediates contact inhibition by interfering with the transduction of Ras dependent proliferation signals. This growth inhibiting ability of merlin is associated with its dephosphorylation at serine 518. When merlin is phosphorylated by PAK-2 or PKA at this site, it cannot inhibit cell growth.

In order to identify the activating phosphatase of merlin, RT4 cells were engineered to express C-terminal merlin (C-merlin, 300-595). This C-terminal part of merlin contains the critical serine 518 site and is regulated similarly to full-length merlin in these cells. At first, PP1 rather than PP2A was identified as the catalytic subunit of the phosphatase, since the dephosphorylation of merlin was inhibited only by high concentrations of okadaic acid and purified PP1 could dephosphorylate C-merlin in vitro more efficiently than PP2A. Myosin/moesin phosphatase consisting of PP1δ as the catalytic subunit and MYPT-1 as the target subunit was then identified as the phosphatase of merlin. i) Merlin interacted directly with MYPT-1 both in vivo and in vitro. This direct interaction was mediated by a region from residue 312 to 341 in merlin and the leucine zipper domain in MYPT-1. ii) A naturally occurring mutation of the nf-2 gene (L339F) in this interacting region could impair the interaction of merlin with MYPT-1. iii) Under conditions when merlin was dephosphorylated, this phosphatase was activated via its dephosphorylation at threonine 696. iv) Furthermore, merlin could not be dephosphorylated and lost its growth inhibitory ability in the presence of CPI-17, a specific inhibitor of myosin/moesin phosphatase. Finally, CPI-17 was able to induce transformation by inhibiting the activation of merlin and is therefore proposed to be a novel oncoprotein.

In conclusion, this study reveals that myosin/moesin phosphatase is the activating phosphatase of merlin and plays a central role in mediating contact inhibition.

Aktivierung des Tumorsuppressor-Proteins Merlin durch Myosin/Moesin Phosphatase

Zusammenfassung
Eine der wichtigsten Eigenschaften von normalen Zellen im Unterschied zu Krebszellen besteht in der Hemmung des Wachstums unter Zell-Zell-Kontakt Bedingungen. Das Tumorsuppressor-Protein Merlin spielt in der Etablierung und Aufrechterhaltung dieser Kontaktinhibition eine entscheidende Rolle. Merlin wird bei Erreichen einer hohen Zelldichte aktiviert und vermittelt die Kontaktinhibition, indem Ras-abhänginge Proliferationssignale gehemmt werden. Diese wachstums-inhibitorische Fähigkeit Merlins ist mit seiner Dephosphorylierung am Serinrest 518 verbunden. Erfolgt durch die Kinasen PAK-2 oder PKA eine Phosphorylierung an dieser Stelle kann Merlin das Zellwachstum nicht mehr inhibieren.

Um die Merlin-aktivierende Phosphatase zu identifizieren, wurden RT4 Zellen verwendet, die den C-Terminus von Merlin (C-Merlin, 300-595) künstlich überexprimieren können. Der C-Terminus enthält den kritischen Serinrest 518 und wird in diesen Zellen ähnlich dem vollständigen Merlin reguliert. Die Dephosphorylierung von Merlin konnte erst durch hohe Konzentrationen Okadainsäure inhibiert werden, welches eher auf PP1 als auf PP2A als katalytische Untereinheit schließen ließ. Weiterhin konnte C-Merlin in vitro durch aufgereinigte PP1 effizienter dephosphoryliert werden als durch PP2A. Die Myosin/Moesin Phosphatase, welche aus PP1 als katalytischer und aus MYPT-1 als regulatorischer Untereinheit besteht, wurde dann als Phosphatase von Merlin identifiziert. i) Merlin interagierte in vitro und in vivo direkt mit MYPT-1. Diese direkte Interaktion wird in Merlin durch die Aminosäuren 312 bis 341 und in MYPT-1 durch die Leucinreißverschluss-Domäne vermittelt. ii) Eine natürlich vorkommende inaktivierende Mutation des nf-2 Gens (L339F) in dieser Interaktionsregion verhindert die Bindung von MYPT-1 an Merlin. iii) Unter Bedingungen, unter denen Merlin dephosphoryliert ist, ist die Myosin/Moesin Phosphatase durch Dephosphorylierung am Threonin 696 ebenfalls aktiviert. iv) Schließlich konnte gezeigt werden, daß Merlin in Gegenwart von CPI-17, einem spezifischen Myosin/Moesin Phosphatase Inhibitor, nicht mehr dephosphoryliert werden und als Tumorsuppressor wirken kann. Konsequenterweise induziert CPI-17 durch Inhibition der Merlinaktivierung Transformation von Zellen und wird daher als neues Onkoprotein vorgeschlagen.

Diese Studie zeigt, daß die Myosin/Moesin Phosphatase die Merlin-aktivierende Phosphatase ist und eine zentrale Rolle in der Vermittlung der Kontaktinhibition spielt.

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