Forschungszentrum
Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte – FZKA 7106
Biochemische
Charakterisierung der Isoprensynthase aus der Graupappel (Populus x canescens
(Ait.) Sm.) und ihre Expression in Arabidopsis thaliana L.
Anette Bachl
Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit
wurden die native ISPS aus der Graupappel (Populus x canescens (Ait.) Sm.) und
verschiedene heterolog in Escherichia coli exprimierte Derivate, mit
C-terminalem bzw. N-terminalem His-Tag sowie unmarkiert, biochemisch charakterisiert.
Die ISPS zeigte ein Temperaturoptimum von 40°C, ein breites pH-Optimum von pH 7
- 8,5 und einen apparenten Km-Wert im millimolaren Bereich. Zudem konnte
festgestellt werden, dass die Enzymkinetik einen sigmoiden Verlauf aufwies, der
auf eine positive Kooperativität des Enzyms hinweist. Die N-terminale Markierung
der ISPS hat eine Verschiebung des pH-Optimums weiter in den alkalischen
Bereich zur Folge, während die C-terminal markierte ISPS im Vergleich zum
N-terminal markierten Enzym eine geringere Aktivität besaß. Durch die vergleichsweise
hohe Affinität zum Substrat fiel jedoch der Unterschied bei geringen Substratkonzentrationen
weniger stark aus. Das Temperaturoptimum ist bei C-terminaler Markierung um ca.
5-10°C erhöht, die Aktivierungsenergie um 50 %. Alle übrigen Eigenschaften
blieben weitgehend konstant.
Zur Transformation von Pflanzen
wurden zwei ispS-Genderivate hergestellt. Dazu wurde das ispS-Gen aus einer
cDNA-Bank der Graupappel mit zwei unterschiedlichen Epitopen markiert, um das
resultierende Protein besser nachweisen und aufreinigen zu können. Es wurde
jeweils am C-terminalen Ende der ISPS ein Epitop angehängt, das HA-Epitop, ein
Nonapeptid (YPYDVPDYA) und ein His-Tag, bestehend aus sechs aneinander
gereihten Histidinen.
Die Funktionsfähigkeit der beiden
ISPS-Derivate wurde durch heterologe Expression in E. coli überprüft. Dabei
stellte sich heraus, dass das HA-Epitop zu einem völligen Verlust der
Enzymaktivität der ISPS führte. Das Derivat mit His-Tag zeigte dagegen etwa 20
% der Aktivität der unverändert in Bakterien exprimierten ISPS.
Mit dem funktionsfähigen
ISPS-Derivat mit His-Tag wurde Arabidopsis thaliana L. transformiert. Als
Transformationsvektor wurde der binäre Vektor pBinAR verwendet, der einen
35S-Promotor und eine Kanamycin-Resistenz enthält. Die Übertragung auf die
Pflanze erfolgte über Agrobacterium tumefaciens.
Es konnten 40 positive Linien über
die Kanamycin-Resistenz selektiert werden, vier davon stammten aus einer ersten
Transformation und konnten bereits geselbstet werden, die 36 aus einer späteren
Transformation stammenden Linien lagen heterozygot vor.
Die stabile Insertion des ispS-Gens
in das Genom von A. thaliana konnte für alle 40 Linien über PCR verifiziert
werden. Die Genexpression konnte in 38 der 40 A. thaliana-Linien auf RNA-Ebene
nachgewiesen werden. Eine erhöhte Isoprenemission konnte für fünf der 40 Linien
gemessen werden, für die auch die Höhe der Genexpression über quantitative
RT-PCR ermittelt wurde. Zwei der fünf Linien zeigten gleichzeitig zur erhöhten
Isoprenemission eine erhöhte Genexpression. Als Grund für die geringe Erhöhung
der Isoprenemission wird ein Substratmangel für die ISPS in A. thaliana
vermutet, zu dem eine geringere Aktivität des Enzyms durch die C-terminale Markierung
hinzukommt.
Biochemical Characterisation of Isoprene Synthase from Poplar
(Populus x canescens (Ait.) Sm.) and its Expression in Arabidopsis thaliana L.
Abstract
It is known that a lot of plant species emit high amounts of
isoprene, especially during high temperature periods. The physiological impact
of isoprene biosynthesis and emission is currently still unknown. An enhanced
heat tolerance as well as an antioxidant action of isoprene is mainly
discussed. One of the main goals of this work was therefore to produce transgenic
plants differing from the corresponding wildtype in their ability to synthesize
and emit isoprene. Therefore, the isoprene synthase (ispS) gene from poplar
(Populus x canescens), which was isolated by MILLER ET AL. (2001) was used to
transform Arabidopsis thaliana L., which is not a significant isoprene emitter.
Prior to transformation the original DNA-sequence was extended by two different
epitops, a nonapeptide HA epitope and six triplets for histidine resulting in a
C-terminal His-tag, in order to get a labelled enzyme, which can be detected
and cleaned up more easily afterwards. For proving the efficiency of the resulting
proteins, the core enzymes without the transit peptide needed for the import of
the protein, which is encoded in the nucleus, into the chloroplasts were
expressed heterologous in E. coli. The HA epitope resulted in a complete loss
of enzyme activity, while the His-tag led to a decreased enzyme activity of
about 20 %.
For the Agrobacterium mediated transformation of A. thaliana the ispS with
the C-terminal His-tag was used and cloned into the binary vector pBinAR under
the control of a 35S promoter. 40 transgenic lines, which were selected by
kanamycine resistance, have been achieved. The stable integration of ispS was
confirmed on DNA- as well as on RNA level. The expression of ispS was proved in
38 of the 40 lines by PCR from cDNA. Furthermore the emission of the transgenic
lines was studied by measuring whole plants for several hours. Five of the 40
lines showed significant higher isoprene emission rates being more than 2,5 fold
higher than in the measured non emitting A. thaliana plants. Two of the five
new isoprene emitting plants showed coevally to the higher emission rates also
a higher gene expression rate for the ispS, which was measured by quantitative
RT PCR.
In addition, native isoprene synthase (ISPS) from poplar as well as
different derivates from it were characterised biochemically. The native enzyme
and the unlabelled heterologous in E. coli expressed ISPS acted very similar. Isoprene
synthase has a Km in the range of millimolar, a temperature optimum of 40
degrees and a broad pH-optimum of 7 to 8.5. Integration of an N-terminal
His-tag led to a shifted pH-optimum to the alkaline side while the C-terminal
His-tag had more influence. As indicated by the in vivo-expression analysis in
E. coli, this manipulation led to a decrease in enzyme activity. The C-terminal
his-tag also resulted in a higher temperature optimum and a higher activating
energy.
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