Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte – FZKA 7124

Regulation of the p53 tumor suppressor protein by Glycogen Synthase Kinase 3

Roman Kulikov

Abstract
The Mdm2 oncoprotein regulates abundance and activity of the p53 protein, one of the most important tumor suppressor proteins in higher eucaryotic cells. For efficient degradation of p53, the Mdm2 protein needs to be phosphorylated at several contiguous residues within the central conserved domain.

I found that glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) phosphorylated the Mdm2 protein in vitro and in vivo within the central domain. Inhibition of GSK 3 with synthetic compounds or siRNA rescued p53 from degradation in an Mdm2-dependent manner despite its association with the Mdm2 protein and ubiquitylation. Localization of the p53 and Mdm2 proteins or the interaction of the Mdm2 and MdmX proteins were not affected but inhibition of GSK 3 decreased the association of the Mdm2 protein with the proteasome. The accumulated p53 protein induced transcription of the p21/waf1 and mdm2 gene but not of pro-apoptotic genes such as bax or puma. Ionizing irradiation, which leads to p53 accumulation directed phosphorylation of GSK 3 at serine 9, which preceded and overlapped with the increase in p53 levels. Moreover, expression of a GSK 3 mutant refractory to ionizing irradiation-induced phosphorylation reduced the accumulation of p53. I therefore conclude that GSK 3 regulates p53 levels by phosphorylating key sites in the central domain of the Mdm2 protein. My data also reveal a new mechanism for DNA damage-induced p53 accumulation and describe a post-ubiquitylation function of the Mdm2 protein, the interaction of the Mdm2 protein with the proteasome.

Regulation des Tumorsuppressor Proteins p53 durch die Glykogen Synthase Kinase 3

Zusammenfassung
Das Mdm2 Onkoprotein reguliert Menge und Aktivität des p53 Protein, eines der wichtigsten Tumorsupressorproteine in höheren eucaryotischen Zellen. Für einen effizienten Abbau des p53 Proteins muss das Mdm2 Protein an mehreren zusammenhängenden Phosphorylierungsstellen innerhalb des zentralen konservierten Bereichs phosphoryliert sein.

Während meiner Doktorarbeit fand ich, dass die Glykogen synthase kinase 3 (GSK 3) das Mdm2 Protein in vitro und in vivo innerhalb des zentralen Bereichs phosphoryliert. Hemmung von GSK 3 mit synthetischen Inhibitoren oder siRNA verhinderte den Abbau des p53 Proteins in einer Mdm2 abhängigen Weise, obwohl das p53 Protein an das Mdm2 Protein gebunden war und durch das Mdm2 Protein ubiquityliert wurde. Auch die Lokalisierung der p53 und Mdm2 Proteine oder die Interaktion der Mdm2 und MdmX Proteine war durch die Inhibition von GSK 3 nicht betroffen. Die Hemmung von GSK 3 verminderte jedoch die Bindung des Mdm2 Proteins an das Proteasom. Die Mengenzunahme des p53 Protein führte zur Transkription des p21/waf1 und mdm2 Gens, nicht aber zur Transkription apoptotischer Gene wie bax oder puma. Nach ionisierender Strahlung, die zur Mengenzunahme des p53 Proteins führt, wird GSK 3 an Serin 9 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung geht der p53 Mengenzunahme voraus und überlappt teilweise mit ihr. Darüberhinaus reduzierte die Expression einer GSK 3 Mutante, die gegen die Phosphorylierung durch ionisierende Strahlung resistent war, die Ansammlung des p53 Proteins.

Ich schließe aus diesen Ergebnissen, dass GSK 3 das p53 Protein reguliert, indem es wichtige Phosphorylierungsstellen phosphoryliert, die im zentralen Bereich des Mdm2 Proteins liegen. Meine Daten weisen außerdem auf einen neuen Mechanismus für die schadensinduzierte Ansammlung des p53 Proteins hin und beschreiben eine postubiquityläre Funktion des Mdm2 Proteins, die Interaktion des Mdm2 Proteins mit dem Proteasom.

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