Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7156

Funktionelle Charakterisierung von Pip92

Ingmar Scholl

Zusammenfassung
Das weitgehend unerforschte immediate-early-gene pip92 rückte in den letzten Jahren bei der Arbeitsgruppe Sleeman in den Focus der Forschung, da es bei den miteinander verbundenen Prozessen Tumorprogression/Zellzykluskontrolle/Apoptose und Metastasierung/Zellmigration assoziiert oder involviert ist. Ob Pip92 eine regulierende Rolle bei diesen Prozessen einnimmt, sollte im Zuge dieser Arbeit durch funktionelle Analysen beantwortet werden. Hierbei wurde der Schwerpunkt auf die Erforschung der Funktion von Pip92 bei Zellmigrationen, Zellzyklusregulation und Apoptose gesetzt.

Es wurden zwei verschiedene Zelllinien als Versuchsobjekte gewählt: die schwach metastasierenden Bsp73-1AS-Zellen, die sich gegenüber ihren genetisch verwandten Bsp73-ASML-Zellen unter anderem in der geringeren pip92-Expression unterscheiden und immortalisierte NIH 3T3-Fibroblasten.

Das Protein gilt als zytoplasmatisch. Erste Hinweise, dass es auch im Kern lokalisiert ist, konnte N.Novac (2001) sammeln. Ich konnte diese Beobachtungen in NIH 3T3-Fibroblasten nicht nur bestätigen, sondern auch einen Zusammenhang von subzellulärer Lokalisation und Kontaktinhibition herstellen. Das Protein ist bei Subkonfluenz im Kern, bei konfluenten Zellen im Zytoplasma. Diesem Mechanismus folgt das seruminduzierte, das ektopisch exprimierte und teilweise auch das durch Anisomycin induzierte Pip92. Funktionelle Versuche zeigen, dass der nukleäre Export durch das CRM1-Protein vermittelt wird.

Die nukleäre Lokalisation des Proteins in Fibroblasten bei geringer Zelldichte kann mit zwei unterschiedlichen Wirkungen auf die Zellen in Bezug gesetzt werden: Einerseits scheint es in NIH 3T3-Fibroblasten den durch Serumentzug ausgelösten Eintritt in die Ruhephase des Zellzyklus zu blockieren, andererseits fördert es in ruhenden Fibroblasten die Apoptose. Konfluente Fibroblasten zeigen beide Phänomene nicht.

Die schon beobachtete migrationsfördernde Wirkung des Proteins auf Bsp73-1AS-Zellen konnte durch zusätzliche Versuche bestätigt und auch durch mehrere Versuche in NIH 3T3-Fibroblasten nachgewiesen werden. Dies kann aber, genau wie in Bsp73-1AS-Zellen, nicht mit einer veränderten Adhäsion an ECM- und Basallaminakomponenten korreliert werden. Versuche, durch konstitutive Überexpression von pip92 in Fibroblasten diese zu transformieren, zeigten, dass das Wildtyp-Protein dies nicht vermitteln kann. Durch die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die Funktion von Pip92 steigert sich das Verständnis der physiologische Relevanz von pip92-Expression wesentlich.

Functional Characterisation of Pip92

Abstract
The function of the immediate early gene pip92 regulation is still poorly understood, but in the last years the Sleeman lab has shown that there is a strong functional correlation between pip92 and tumor progression, metastatsis and cell migration. The aim of this thesis was to address the question of how pip92 regulates these processes. The work was focused on functional studies of pip92 in cell migration, cell cycle regulation and apoptosis, and used two different cell systems, namely (i) the poorly metastatic cell line Bsp73-1AS, that differs from its counterpart ASML by low Pip92 expression (ii) immortalized NIH 3T3 fibroblasts, that express Pip92 endogenously during the G0/G1 transition

Despite the fact that Pip92 is described in the literature as being a cytoplasmic protein, the Sleeman lab have found evidence in tumor cells that pip92 can also be localized in the nucleus (unpublished data). In my work I could confirm this observation in NIH 3T3 fibroblasts. Furthermore, I could show that there is a direct relationship between expression and subcellular localisation of Pip92 and contact inhibition. Under subconfluent conditions Pip92 is constititively expressed endogenously and is localized in the nucleus. The same subcellular localisation was observed with ectopically expressed Pip92. Conversely, virtually no endogenous Pip92 was found to be expressed in confluent fibroblasts, while ectopically expressed Pip92 protein localised exclusively to the cytoplasm. The effect of contact inhibition on Pip92 localisation was also shown with serum- and anisomycin-induced endogenous Pip92 expression. Functional studies using Leptomycin B showed that nuclear export is mediated by CRM1. In fibroblasts at low density, Pip92 blocks entry into G0 in starved fibroblasts, yet promotes apoptosis in quiescent cells. These phenomena were not observed in confluent fibroblast. In addition to regulating the cell cycle and apoptosis, I showed that pip92 promotes cell migration in both Bsp73-1AS tumor cells and NIH 3T3 cells. This effect is not a consequence of an altered adhesion to ECM or basal lamina components. Finally, investigations with constitutively expressed pip92 in fibroblasts suggest that Pip92 does not have an oncogenic effect.

Together the data presented in this work increase the understanding of the physiological relevance of pip92 expression.

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