Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte – FZKA 7159
Chips und ASAP1: funktionelle
Genomik der Tumormetastasierung
Thomas Müller
Zusammenfassung
Mittels
Suppressions-Subtraktions-Hybridisierung (SSH) wurden über ein differentielles Screening
Gene identifiziert, die mit Tumorprogression und Metastasierung assoziiert sind.
Insgesamt 268 Gene werden in den hoch-metastatischen Zelllinien ASML und MTLy überexprimiert,
nicht jedoch in ihren nicht-metastatischen Gegenstücken.
Während meiner Doktorarbeit war es zunächst
das Ziel, unter diesen Genen diejenigen zu identifi zieren, welche in einem
weiteren Tumorprogressionsmodell ebenfalls differentiell exprimiert werden und
eine Korrelation zum metastatischen Phänotyp aufweisen. Dies geschah mit Hilfe
der DNA-Mikroarray-Technologie. Alle 268 SSH-Gene, die sich in zwei
subtraktiven Bibliotheken befanden, wurden auf Glaschips gespottet und mit
Fluoreszenz-markierter cDNA aus der nicht-metastatischen Zelllinie G und der
hoch-metastatischen Zelllinie MatLylu hybridisiert. Anhand der Auswertung
dieser Hybridisierungen konnten 40 Gene identifiziert werden, die Assoziation
zum metastatischen Phänotyp in unterschiedlichen Tumorprogressionssystemen zeigen.
Unter diesen Genen befinden sich zahlreiche Gene, die bereits im Zusammenhang
mit Tumorprogression oder Metastasierung in der Literatur beschrieben sind. Es
wurden außerdem Gene identifiziert, die in diesem Zusammenhang noch nicht in der
Literatur Erwähnung finden und einige noch völlig unbeschriebene Gene (novels).
Unter den identifizierten Genen, die noch
nicht im Zusammenhang mit der Tumorprogression oder der Metastasierung
beschrieben sind, befindet sich das Gen ASAP1. Dieses Gen wurde für
weiterführende Charakterisierungen ausgewählt. ASAP1 ist ein
Multidomänenprotein, das mit zahlreichen Proteinen interagieren kann. Unter den
bereits beschriebenen Interaktionspartnern befi nden sich die Tyrosinkinasen Src,
Crk, FAK und Pyk2. Interaktionen mit ARF1 und ARF5, zwei Mitgliedern der Ras-Superfamilie,
sind ebenfalls in der Literatur beschrieben. Weitere bereits identifi zierte Interaktionspartner
sind das Phospholipid PIP2 und das in den EGF-Rezeptor-Verkehr eingreifende Strukturprotein
CIN85. Mit diesen Interaktionspartnern kann ASAP1 in für die Metastasierung
wichtigen Modifikationen des Membranverkehrs, des Actinskeletts, des Phospholipidmetabolismus
und des Zellwachstums eingreifen. In situ Hybridisationen, welche mit humaner
ASAP1-cDNA durchgeführt wurden und immunhistochemische ASAP1 Expressionsstudien,
mit von mir generierten anti- huASAP1-Antikörpern (IHC), zeigten eine Assoziation
der ASAP1-Expression zum neoplastischen Phänotyp. Um nun Einblicke in die
Funktion von ASAP1 hinsichtlich der Tumorprogression und der Metastasierung zu bekommen,
wurde der Phänotyp von nicht-metastatischen 1AS-Bsp73 Zellen untersucht, die
sowohl transient als auch stabil ASAP1 überexprimieren. Hierfür wurde eine von
mir neu identifizierte konstitutiv aktive Spleißvariante von ASAP1 eingesetzt
(rASAP1c). Es wurde ebenfalls der Phänotyp von hochmetastatischen ASML-Bsp73
Zellen untersucht, die transient oder stabil dominant negative ASAP1-Konstrukte
überexprimieren. 1ASZellen, die ASAP1 überexprimieren, zeigen im Vergleich mit
Vektorkontrollen in in vitro Wundheilungsexperimenten eine erhöhte Motilität,
was darauf hinweist, dass ASAP1 zu der Gruppe von Genen zählt, die für die
Regulation der Zellmigration verantwortlich ist. Die Überexpression von ASAP1
in 1AS-Zellen führt auch zu einer erhöhten Adhäsion an Fibronektin, wie in
vitro Adhäsionsstudien zeigten. Diese Eigenschaft könnte z.B. über die Integrinsignalwege
zu einer erhöhten Ausschüttung von Proteasen führen, was Pfade für die
metastasierende Zelle in die extrazelluläre Matrix und durch Basalmembranen schaffen
kann. Tierversuche mit 1AS-Tumoren, die rASAP1c überexprimieren, zeigten, dass
diese Tumore zu Lungenmetastasen führen, was bei den Vektorkontrollen nicht der
Fall war. Ebenfalls durchgeführte Tierversuche mit ASML-Tumoren, die dominant
negative ASAP1-Varianten überexprimierten, zeigen dass die somit erreichte
Blockierung der ASAP1-Funktion zu einer signifikanten Reduzierung der
Metastasierung in die Lymphknoten und die Lunge führt.
Durch die vorliegende Arbeit konnten also
Gene identifiziert werden, die in mehreren Tumorprogressionssystemen
differentiell exprimiert sind. Zusätzlich konnte einem dieser Gene - ASAP1 -
eine funktionelle Beteiligung beim Prozess der Metastasierung nachgewiesen werden.
Chips and ASAP1: functional genomic of the tumour metastasis
Abstract
The differential screening method of Suppression Subtractive
Hybridisation (SSH) has been used to identify genes associated with tumour
progression and metastasis. Together 268 genes have been found to be
up-regulated in the highly metastatic cell lines ASML and MTLy in comparison to
its non-metastatic counterparts.
In my thesis I have screened this group of genes to identify those that
are differentially expressed in further tumour progression systems and show a
correlation to the metastatic phenotype.This was achieved with the help of the
DNA microarray technology. All the 268 genes were bound on glas chips and
hybridised with fl uorescent labeled cDNA isolated out of the non-metastatic
cell line G and the highly metastatic cell line MatLylu.
As a result of the hybridisation assays 40 genes have been identified
showing association to the metastatic phenotype in varying tumour progression
systems. Numerous of these genes have already been descibed in the literature
as being associated to tumour progression or metastasis. Some of the identified
genes have not been reported being related to tumour progression or metastasis
and some of these genes are completely unknown (novels).
One of these genes which has not been reported being related to tumour
progression or metastasis is ASAP1.This gene was chosen for further studies.
ASAP1 is a muliple domain protein that can interact with numerous proteins.
Known interaction partners of ASAP1 are the tyrosine kinases Src, Crk FAK and
Pyk2. Interactions with ARF1 and ARF5, two members of the Ras-superfamily have
been descibed in the literature already.
Further known interaction partners of ASAP1 are the phospholipid PIP2 and
the scaffold protein CIN85 a regulator of the EGF receptors trafficking. By
interacting with the proteins ASAP1 can regulate important cell functions like
membrane remodeling, cytoskeleton organization, phospholipid metabolism and
cell growth.
An association to the neoplastic phenotype of the ASAP1 expression was
revealed by in situ hybridisations with human cDNA and by immunohistochemistry
assays using generated anti huASAP1 antibodies. To get an insight into the
function of ASAP1, the phenotype of 1ASBsp73 cells transiently and stabely
overexpressing ASAP1 was studied. For these assays a newly identifi ed
constitutive active alternative spliced variant of ASAP1 (rASAP1c) was used. Further
studies concerning the phenotype of highly metastatic ASML-Bsp73 cells
transiently and stabely overexpressing ASAP1 were performed.
1AS cells ectopically expressing ASAP1 exihibit a higher migration rate in
wound healing assays in comparison to empty vector transfected cells,
suggesting that ASAP1 belongs to the set of genes responsible for regulating
cell migration. 1AS cells overexpressing ASAP1 showed elevated adhesion to fibronectin,
which was proven by in vitro adhesion assays. This might lead to a higher
secretion rate of proteases via integrin signalling pathways, and therefore
generating paths through the extracellular matrix and basal membranes for the metastasizing
cell.
Animal experiments with 1AS-tumours overexpressing ectopic rASAP1c showed
that these tumours are generating lung metastases, which were not generated by
empty vector expressing 1AS-tumours.
Blocking the ASAP1 function in the cell by overexpressing dominant
negative ASAP1 constructs in ASML tumours is leading to a reduction of
metastases formation to the lymphknodes and the lung.
In my thesis I was able to identify genes being differentially expressed
in various tumour progression systems. As a further step one of these genes
– ASAP1- was identified being functionally involved in the process of
tumour metastasis.
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