Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte – FZKA 7163

Molecular dissection of the Sec62/63p complex, a member of protein translocation machinery of the endoplasmic reticulum membrane

Xian Wang

Abstract
The heterotetrameric Sec62/63p complex associates with the heterotrimeric Sec61p complex to assemble into the heptameric Sec complex. This complex is necessary and sufficient for posttranslational protein translocation across the membrane of the endoplasmic reticulum. The transmembrane proteins Sec62p and Sec63p are two essential members of this complex.

In my PhD project, I showed that Sec63p is phosphorylated at its C-terminal domain by protein kinase CK2 in vivo and in vitro. Both threonine 652 and threonine 654 of Sec63p are phosphorylated and the tight assembly of Sec62/63p complex is dependent on the phosphorylation of both residues in vivo and in vitro. Exchanging either threonine 652 or threonine 654 against the nonphosphorylatable alanine in Sec63p impairs the binding to Sec62p and causes protein translocation to occur less efficiently across the membrane of the endoplasmic reticulum.

Sec63p is constitutively phosphorylated and the fraction of phosphorylated Sec63p does not change upon certain stress conditions. A phosphorylation mediated regulation of protein translocation was therefore not observed.

Furthermore, I mapped the complete binding site of Sec63p for the N-terminal domain of Sec62p to the last 24 C-terminal residues.

In summary, my work shows for the first time that phosphorylation of Sec63p is required to tightly recruit the putative signal sequence receptor Sec62p to the Sec complex. This tight association is required to efficiently initiate posttranslational protein translocation across the membrane of the endoplasmic reticulum.

Molekulare Kartierung des Sec62/63p Komplexes, ein Mitglied der Proteintranslokationsmaschinerie in der Membran des endoplasmatischen Retikulums

Zusammenfassung
Der heterotetramere Sec62/Sec63p Komplex assoziiert mit dem heterotrimeren Sec61p Komplex zu dem heptameren Sec Komplex. Dieser heptamere Sec Komplex ist sowohl notwendig als auch ausreichend für die posttranslationale Translokation on Proteinen über die Membran des endoplasmischen Retikulums. Die beiden ransmembranproteine Sec62p und Sec63p sind essentielle Komponenten dieses Komplexes.

In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass Sec63p an seiner C-terminalen Domäne von er Proteinkinase CK2 sowohl in vivo als auch in vitro phosphoryliert wird. Die hosphorylierung der Threonine in Position 652 und 654 ist eine Voraussetzung für die enge Bindung zwischen Sec63p und Sec62p. Dies bestätigen sowohl biochemische Bindungstests als auch Messungen in der lebenden Zelle. Wird eines der beiden Threonine gegen ein nicht phosphorylierbares Alanin ausgetauscht, so wird eine Schwächung der Sec62/63p Bindung und damit einhergehend eine weniger effiziente Proteintranslokation über die Membran des endoplasmischen Retikulums beobachtet.

Sec63p wird von CK2 konstitutiv phosphoryliert und der Grad dieser Phosphorylierung scheint sich unter verschiedenen zellulären Bedingungen nicht zu verändern. Eine Regulation der Proteintranslokation konnte daher nicht nachgewiesen werden.

Durch weitere genetische und biochemische Experimente konnte ich die vollständige Bindungstelle von Sec63p für die N-terminale Domäne von Sec62p auf die letzten 24 Aminosäuren eingrenzen.

Meine Arbeit weist so zum erstenmal den Einfluss einer Phosphorylierung auf die Eigenschaften des heptameren Sec Komplexes nach. Erst wenn Sec63p phosphoryliert wird kann es den putativen Signalsequenzrezeptor Sec62p eng genug rekrutieren, um die Translokation von Proteinen über die Membran des endoplasmischen Retikulums auch effizient zu initiieren.

VOLLTEXT

BIBLIOTHEK