Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7217 

Identifizierung des molekularen Targets bei der Apoptose-Induktion durch Alkylphosphocholine

Carolin Oberle

Zusammenfassung
Alkylphosphocholine (APC) repräsentieren eine neue Klasse anti-tumoraler Wirkstoffe, die im Gegensatz zu konventionellen anti-Krebs Medikamenten nicht in die zelluläre Replikationsmaschinerie eingreifen, sondern an der Plasmamembran der Zellen wirken. Es handelt sich bei diesen Verbindungen um synthetische Phospholipide, die durch spezifische Modifikationen nur schlechte Substrateigenschaften für phospholipidmetabolisierende Enzyme besitzen und somit gegenüber dem Abbau durch zelluläre Phospholipasen resistent sind. APC sind daher wesentlich stabiler, reichern sich in der Plasmamembran der Zellen an und führen dort zu Ereignissen, die den Tod der entarteten Zelle bewirken.

Einer der bedeutensten Mechanismen, durch welchen APC die Zerstörung von Tumorzellen hervorruft, ist die Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose). In der vorliegenden Arbeit wurde die Apoptose-induzierende Wirkung einer speziellen APC-Verbindung, dem S-NC-2, an in vitro Zellkultursystemen humaner Krebszelllinien eingehend untersucht.

Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer und biochemischer Methoden konnte die zytotoxische Wirkung von S-NC-2 deutlich auf die Induktion der Apoptose zurückgeführt werden. Die Aktivierung von Initiator- und Effektor-Caspasen sowie die Spaltung spezifischer Todessubstrate erwiesen sich als deutliche Merkmale des programmierten Zelltods.

Als wichtiges regulatorisches Element bei der S-NC-2 induzierten Apoptose konnte der CD95-Todesrezeptor identifiziert werden. Immunhistochemische Studien demonstrierten ein durch S NC 2 induziertes Clustering der Rezeptormoleküle sowie deren Translokation in bestimmte Mikrodomänen der Plasmamembran (Lipid Rafts). Die Behandlung genetisch veränderter Zelllinien, denen wichtige Bestandteile der CD95-Signalweiterleitung oder der Rezeptor selbst fehlen, zeigten eine drastische Reduktion der Apoptose-induzierenden Wirkung von S-NC-2.

Zusätzlich zum CD95-Todesrezeptor konnte eine Beteiligung der Mitochondrien und der Lysosomen am S-NC-2 induzierten Zelltod beobachtet werden. Der Verlust der Membranintegrität sowie die Freisetzung pro-apoptotischer Proteine, wie Cytochrom c oder Cathepsin B, erwiesen sich als deutliche Marker für die Beteiligung dieser Organellen. In Abhängigkeit vom Zelltyp konnte die Apoptose durch eine Überexpression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 verhindert werden.

Eine weitere Besonderheit der APC ist deren Selektivität gegenüber Tumorzellen. Dies trifft auch für die Substanz S-NC-2 zu. Im Gegensatz zu Krebszellen konnte bei vergleichbaren Konzentrationen und Inkubationszeiten keine zytotoxische Wirkung der Substanz in primären Blutzellen beobachtet werden.

Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die Wirkungsweise synthetischer Phospholipide, im Speziellen S-NC-2, kann als interessanter Grundbaustein für die Entwicklung neuer, zielgerichteter Krebsmedikamente dienen.

Identification of the molecular target of Alkylphosphocholine-induced apoptosis

Abstract
Alkylphosphocholines (APCs) represent a new class of anti-tumour agents. In contrast to most of the conventional anti-cancer drugs, these compounds do not act on the cellular DNA but operate on the level of the plasma membrane. APCs are synthetic phospholipids, which show only marginal substrate features to phospholipid metabolising enzymes. Due to small chemical alterations they are stable compounds and exhibit a strongly increased resistance to phospholipase degradation. As a result APCs accumulate in the plasma membrane of the target cells and lead to dramatic alterations, which finally result in death. One of the most significant mechanisms of APC induced tumour cell death is via the initiation of apoptosis (programmed cell death). In the present study, the focus was set on the investigation of the apoptosis-inducing potency of one special APC-compound, the S-NC-2. The induction of apoptosis in neoplastic cells was clearly demonstrated by the use of different microscopic and biochemical methods, the investigation of initiator- and effector-caspases-activation as well as the cleavage of specific death substrates that were shown to be specific markers of programmed cell death.

One important regulatory element of S-NC-2 induced apoptosis could be identified as the CD95 death receptor. Immunohistochemical studies demonstrated a clustering of the death receptor molecules upon S-NC-2 treatment as well as a translocation of the receptors to specific microdomains of the plasma membrane – the so called lipid rafts. The use of genetically modified cell lines, which were deficient in important molecules of the CD95 signal transduction pathway, or even in the death receptor itself, demonstrated a dramatic reduction of the apoptosis inducing potency of S NC-2. Furthermore, the participation of the mitochondrial and the lysosomal pathway could be identified in the signalling pathway. The loss of the mitochondrial/lysosomal membrane integrity as well as the release of pro-apoptotic molecules like cytochrome c and cathepsin B, were obvious markers for the participation of these organelles in S-NC-2 induced cell death. Moreover, depending on the cell type, apoptosis could be blocked by the overexpression of the anti-apoptotic protein Bcl-2.

An additional particular feature of APCs is their selectivity towards tumour cells that could also be demonstrated for the compound S-NC-2. The comparison of primary peripheral blood lymphocytes and leukaemia cells on their sensitivity to S-NC-2 treatment showed a strong cytotoxic effect in neoplastic cells, whereas normal cells were spared.

As the majority of anti-cancer agents damage besides tumour cells also fast growing healthy tissue, it is of great importance to find new strategies of chemotherapeutic application. Promising candidates are the APCs and the knowledge about the mode of action of one special APC, the S NC 2, which was achieved in this study, can be accounted as an interesting and helpful tool for the development of new targeted anti-cancer drugs.

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