Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7217
Identifizierung des
molekularen Targets bei der Apoptose-Induktion durch Alkylphosphocholine
Carolin Oberle
Zusammenfassung
Alkylphosphocholine
(APC) repräsentieren eine neue Klasse anti-tumoraler Wirkstoffe, die im
Gegensatz zu konventionellen anti-Krebs Medikamenten nicht in die zelluläre
Replikationsmaschinerie eingreifen, sondern an der Plasmamembran der Zellen
wirken. Es handelt sich bei diesen Verbindungen um synthetische Phospholipide,
die durch spezifische Modifikationen nur schlechte Substrateigenschaften für
phospholipidmetabolisierende Enzyme besitzen und somit gegenüber dem Abbau
durch zelluläre Phospholipasen resistent sind. APC sind daher wesentlich
stabiler, reichern sich in der Plasmamembran der Zellen an und führen dort zu
Ereignissen, die den Tod der entarteten Zelle bewirken.
Einer der bedeutensten Mechanismen, durch
welchen APC die Zerstörung von Tumorzellen hervorruft, ist die Induktion des
programmierten Zelltods (Apoptose). In der vorliegenden Arbeit wurde die
Apoptose-induzierende Wirkung einer speziellen APC-Verbindung, dem S-NC-2, an
in vitro Zellkultursystemen humaner Krebszelllinien eingehend untersucht.
Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer und
biochemischer Methoden konnte die zytotoxische Wirkung von S-NC-2 deutlich auf
die Induktion der Apoptose zurückgeführt werden. Die Aktivierung von Initiator-
und Effektor-Caspasen sowie die Spaltung spezifischer Todessubstrate erwiesen
sich als deutliche Merkmale des programmierten Zelltods.
Als wichtiges regulatorisches Element bei
der S-NC-2 induzierten Apoptose konnte der CD95-Todesrezeptor identifiziert
werden. Immunhistochemische Studien demonstrierten ein durch S NC 2 induziertes
Clustering der Rezeptormoleküle sowie deren Translokation in bestimmte
Mikrodomänen der Plasmamembran (Lipid Rafts). Die Behandlung genetisch veränderter
Zelllinien, denen wichtige Bestandteile der CD95-Signalweiterleitung oder der
Rezeptor selbst fehlen, zeigten eine drastische Reduktion der
Apoptose-induzierenden Wirkung von S-NC-2.
Zusätzlich zum CD95-Todesrezeptor konnte
eine Beteiligung der Mitochondrien und der Lysosomen am S-NC-2 induzierten
Zelltod beobachtet werden. Der Verlust der Membranintegrität sowie die
Freisetzung pro-apoptotischer Proteine, wie Cytochrom c oder Cathepsin B,
erwiesen sich als deutliche Marker für die Beteiligung dieser Organellen. In
Abhängigkeit vom Zelltyp konnte die Apoptose durch eine Überexpression des
anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 verhindert werden.
Eine weitere Besonderheit der APC ist deren
Selektivität gegenüber Tumorzellen. Dies trifft auch für die Substanz S-NC-2
zu. Im Gegensatz zu Krebszellen konnte bei vergleichbaren Konzentrationen und
Inkubationszeiten keine zytotoxische Wirkung der Substanz in primären
Blutzellen beobachtet werden.
Die in dieser Arbeit gewonnenen
Erkenntnisse über die Wirkungsweise synthetischer Phospholipide, im Speziellen
S-NC-2, kann als interessanter Grundbaustein für die Entwicklung neuer,
zielgerichteter Krebsmedikamente dienen.
Identification of the molecular
target of Alkylphosphocholine-induced apoptosis
Abstract
Alkylphosphocholines (APCs) represent
a new class of anti-tumour agents. In contrast to most of the conventional anti-cancer
drugs, these compounds do not act on the cellular DNA but operate on the level
of the plasma membrane. APCs are synthetic phospholipids, which show only
marginal substrate features to phospholipid metabolising enzymes. Due to small
chemical alterations they are stable compounds and exhibit a strongly increased
resistance to phospholipase degradation. As a result APCs accumulate in the
plasma membrane of the target cells and lead to dramatic alterations, which
finally result in death. One of the most significant mechanisms of APC induced
tumour cell death is via the initiation of apoptosis (programmed cell death).
In the present study, the focus was set on the investigation of the
apoptosis-inducing potency of one special APC-compound, the S-NC-2. The
induction of apoptosis in neoplastic cells was clearly demonstrated by the use
of different microscopic and biochemical methods, the investigation of
initiator- and effector-caspases-activation as well as the cleavage of specific
death substrates that were shown to be specific markers of programmed cell
death.
One important regulatory element of S-NC-2 induced apoptosis could be
identified as the CD95 death receptor. Immunohistochemical studies demonstrated
a clustering of the death receptor molecules upon S-NC-2 treatment as well as a
translocation of the receptors to specific microdomains of the plasma membrane
– the so called lipid rafts. The use of genetically modified cell lines,
which were deficient in important molecules of the CD95 signal transduction
pathway, or even in the death receptor itself, demonstrated a dramatic
reduction of the apoptosis inducing potency of S NC-2. Furthermore, the
participation of the mitochondrial and the lysosomal pathway could be
identified in the signalling pathway. The loss of the mitochondrial/lysosomal
membrane integrity as well as the release of pro-apoptotic molecules like
cytochrome c and cathepsin B, were obvious markers for the participation of
these organelles in S-NC-2 induced cell death. Moreover, depending on the cell
type, apoptosis could be blocked by the overexpression of the anti-apoptotic
protein Bcl-2.
An additional particular feature of APCs is their selectivity towards
tumour cells that could also be demonstrated for the compound S-NC-2. The
comparison of primary peripheral blood lymphocytes and leukaemia cells on their
sensitivity to S-NC-2 treatment showed a strong cytotoxic effect in neoplastic
cells, whereas normal cells were spared.
As the majority of anti-cancer agents damage besides tumour cells also
fast growing healthy tissue, it is of great importance to find new strategies
of chemotherapeutic application. Promising candidates are the APCs and the
knowledge about the mode of action of one special APC, the S NC 2, which was
achieved in this study, can be accounted as an interesting and helpful tool for
the development of new targeted anti-cancer drugs.
VOLLTEXT
BIBLIOTHEK