Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7276

Regulation der Glykogen Synthase Kinase-3β (GSK-3β) nach ionisierender Strahlung

Karen Andrea Böhme

Zusammenfassung
Die Glykogen Synthase Kinase-3β (GSK-3β) phosphoryliert das Mdm2 Protein in der zentralen Domäne. Diese Phosphorylierung ist essentiell für die Degradation des p53 Proteins. Ionisierende Strahlung inaktiviert GSK-3β durch Phosphorylierung an Serin 9 und verhindert dadurch die Mdm2-vermittelte Degradation des p53 Proteins. In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass Akt/PKB das GSK-3β Protein nach ionisierender Strahlung an Serin 9 phosphoryliert. Ionisierende Strahlung führt zur Phosphorylierung des Akt/PKB Proteins an Threonin 308 und Serin 473. Der PI3 Kinase Inhibitor LY294002 verhinderte nach ionisierender Strahlung sowohl die Phosphorylierung des Akt/PKB Proteins an Serin 473 als auch den Anstieg der Phosphorylierung des GSK-3β Proteins an Serin 9. Zellfraktionierungen zeigten nach ionisierender Strahlung eine besonders deutliche Aktivierung von Akt/PKB im Zellkern, während Akt/PKB im Zytoplasma kaum aktiviert wurde. Durch die Verwendung spezifischer siRNA konnte ich feststellen, dass die Aktivierung von Akt1/PKBα, nicht aber die Aktivierung von Akt2/PKBβ, für die Phosphorylierung des GSK-3β Proteins nach ionisierender Strahlung verantwortlich ist. Die zur PI3 Kinase Familie gehörende DNA-abhängige Protein Kinase (DNA-PK), die durch DNA-Doppelstrangbrüche aktiviert wird, phosphoryliert das Akt/PKB Protein nach ionisierender Strahlung. Sowohl in Zellen von SCID Mäusen als auch nach dem Ausschalten der katalytischen Untereinheit von DNA-PK durch siRNA in Osteosarkom Zellen wurde das Akt/PKB Protein nach ionisierender Strahlung nicht länger an Serin 473 phosphoryliert. Dadurch blieb auch die Phosphorylierung des GSK-3β Proteins an Serin 9 aus. In Übereinstimmung mit dem Grundsatz, dass die Phosphorylierung von GSK-3β an Serin 9 zur Stabilisierung des p53 Proteins nach ionisierender Strahlung beiträgt, führte der Verlust der katalytischen Untereinheit von DNA-PK zu einer wesentlich geringeren Mengenzunahme des p53 Proteins nach ionisierender Strahlung. Aus meinen Ergebnissen schließe ich, dass ionisierende Strahlung eine Signalkaskade auslöst, in der DNA-PK die Kinase Akt1/PKBα an Serin 473 phosphoryliert und aktiviert. Akt1/PKBα phosphoryliert und inhibiert wiederum GSK-3β im Zellkern, was zur Hypophosphorylierung des Mdm2 Proteins führt. Durch die Hypophosphorylierung ist das Mdm2 Protein nicht mehr in der Lage die Degradation des p53 Proteins zu vermitteln, welches daraufhin im Zellkern akkumuliert.

Regulation of Glycogen Synthase Kinase-3β (GSK-3β) after ionizing radiation

Abstract
Glycogen Synthase Kinase-3β (GSK-3β) phosphorylates the Mdm2 protein in the central domain. This phosphorylation is absolutely required for p53 degradation. Ionizing radiation inactivates GSK-3β by phosphorylation at serine 9 and in consequence prevents Mdm2 mediated p53 degradation. During the work for my PhD I identified Akt/PKB as the kinase that phosphorylates GSK-3β at serine 9 after ionizing radiation. Ionizing radiation leads to phosphorylation of Akt/PKB at threonine 308 and serine 473. The PI3 Kinase inhibitor LY294002 completely abolished Akt/PKB serine 473 phosphorylation and prevented the induction of GSK-3β serine 9 phosphorylation after ionizing radiation. Interestingly, the most significant activation of Akt/PKB after ionizing radiation occurred in the nucleus while cytoplasmic Akt/PKB was only weakly activated after radiation. By using siRNA, I showed that Akt1/PKBα, but not Akt2/PKBβ, is required for phosphorylation of GSK- 3β at serine 9 after ionizing radiation. Phosphorylation and activation of Akt/PKB after ionizing radiation depends on the DNA dependent protein kinase (DNA-PK), a member of the PI3 Kinase family, that is activated by free DNA ends. Both, in cells from SCID mice and after knockdown of the catalytic subunit of DNA-PK by siRNA in osteosarcoma cells, phosphorylation of Akt/PKB at serine 473 and of GSK-3β at serine 9 was completely abolished. Consistent with the principle that phosphorylation of GSK-3 at serine 9 contributes to p53 stabilization after radiation, the accumulation of p53 in response to ionizing radiation was largely prevented by downregulation of DNA-PK. From these results I conclude, that ionizing radiation induces a signaling cascade that leads to Akt1/PKBα activation mediated by DNA-PK dependent phosphorylation of serine 473. After activation Akt1/PKBα phosphorylates and inhibits GSK-3β in the nucleus. The resulting hypophosphorylated form of Mdm2 protein is no longer able to degrade p53 which in consequence accumulates in the nucleus.

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