Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7285

Analysis of the Molecular Basis Underlying Signal-regulated Splicing via the RNA-binding Protein Sam68

Anne Tisserant

Abstract
Evolution of higher organisms from a surprisingly small number of genes is mainly explained by mechanisms generating multiple proteins from a single gene, the most prevalent of which is alternative pre-mRNA splicing. To ensure an appropriate spatial and temporal expression of splice variants the splicing machinery must be instructed by extracellular cues. The RNA- binding protein Sam68 represents a first splice regulator that is linked to signal transduction. Through phosphorylation by extracellular signal-regulated kinase (ERK) it mediates Raspathway dependent inclusion in CD44 pre-mRNA of a variant exon, v5, often found during immune-ccll activation and tumorigenesis.

The aim of my work was to understand how the Sam68 protein is connected to the splicing machinery and how its signal-dependent modification by ERK may affect exon choice. I show here that, beside the known RNA element within exon v5, there is a second element upstream of the CD44 v5 exon that binds Sam68 in vitro and that both sites determine thggeneral level of v5 exon inclusion in mRNA. Establishing a pre-mRNA immunoprecipitation technique, I could show that Sam68 binds to the pre-mRNA region carrying these sequences also in vivo, and that forced expression of Sam68 enhances binding to pre-mRNA of the general spliceosome component U2AF65, a critical factor for spliceosome assembly. Ras-activation did not further enhance U2AF binding. By coimmunoprecipitations I showed that Sam68 interacts with U2AF65, and with hnRNPA1, an exon silencing factor, previously shown to bind the v5 exon. Intriguingly, the signalling-dependent activation of v5 exon splicing was independent of the RNA-binding ability and Ras-signalling reduced Sam68 binding to the v5 pre-mRNA region in vivo. Similarly, phosphorylation of recombinant Sam68 by ERK impaired its binding to RNA.

The results suggest that Sam68 is part of a multiprotein complex over the v5 exon region and can recruit the spliceosomal factor U2AF65, thus linking Sam68 to spliceosome assembly. This step appears to be independent from cell signalling and leads to pre-formed splice-competent complexes. The data fwther suggest that one step in the splicing activation process involves a weakening or loss of Sam68 binding to RNA via its phosphorylation by ERK. This step might initiate tbe remodeling of the complex allowing further spliceosome assembly and may explain how the signalling-induced modification of Sam68 can affect splicing.

Analyse der molekularen Grundlagen für signalreguliertes Spleißen durch das RNA-Bindeprotein Sam68

Zusammenfassung
Die Evolution höherer Organismen ausgehend von einer überraschend kleinen Zahl an Genen wird vorwiegend durch Mechanismen erklärt, durch die aus einem Gen mehrere Proteine hervorgehen können. Der häufigste dieser Mechanismen ist das alternative Spleißen von prä-mRNA. Um Spleißvarianten räumlich und zeitlich richtig zu exprimieren muß die Spleißmaschinerie durch extrazelluläre Signale gesteuert werden. Das RNA-Bindeprotein Sam68 repräsentiert einen ersten Spleißregulator, der an Signaltransduktionsprozesse gekoppelt ist. Nach Aktivierung des RasSignalweges vermittelt Sam68 über seine Phosphorylierung durch die Extrazelluläre-Signal-Regulierte Kinase (ERK) den Einschluß eines varianten CD44-Exons, v5, in die mRNA. Diese Exonsequenz wird häufig nach der Aktivierung von Immunzellen und bei der Tumorentstehung gefunden.

Ziel meiner Arbeit war es zu verstehen wie Sam68 an den Spleißapparat gekoppelt ist und wie die signalabhängige Modifikation durch ERK die Auswahl von Exons steuern kann. Ich zeige hier, daß, zusätzlich zu dem bekannten RNA-Element innerhalb des CD44-Exon v5, ein zweites Element im davorliegenden intron existiert, das Sam68 in vitro bindet, und daß beide Elemente das Ausmaß des Exon-Einschlusses bestimmen. Über die Etablierung einer Immunpräzipitations-Methode für prä-mRNA konnte ich zeigen, daß Sam68 die diese Elemente enthaltende Region der prä-mRNA auch in vivo bindet und daß die verstärkte Expression von Sam68 zu einer verstärkten Bindung der generellen Spleißosomkomponente U2AF65, einem wichtigen Faktor für die Spleißosombildung, an die prä-mRNA führt. Ras-Aktivierung führte zu keiner weiteren Steigerung der U2AF-Bindung. Co-immunpräzipitationen zeigten zudem die Interaktion von Sam68 mit U2AF und mit hnRNP A1, einem Exon-Silencer-Faktor, der an das v5-Exon bindet. Interessanterweise erfolgte die signalabhängige Aktivierung des Spleißens unabhängig von der RNA-Bindungsfähigkeit von Sam68 und die Aktivierung des Ras-Signalweges reduzierte die Bindung von Sam68 an die prä-mRNA in vivo. Weiterhin hemmte die Phosphorylierung von rekombinantem Sam68-Protein mit ERK dessen RNA-Bindung.

Die Ergebnisse legen nahe, daß Sam68 Teil eines Multiproteinkomplexes an der v5-Exon-Region ist und den Spleißosomfaktor U2AF rekrutieren kann, wodurch Sam68 an den Aufbau von Spleißosomen gekoppelt ist. Dies scheint signalunabhängig zu erfolgen und führt zu vorgeformten spleißkompetenten Komplexen. Weiterhin sprechen die Daten dafür, daß ein Schritt in der Aktiviemg des Spleißens die Hemmung der RNA-Bindung von Sam68 über dessen Phosphorylierung durch ERK ist. Dieser Schritt könnte die Umbildung der Komplexe initieren und den weiteren Zusammenbau der Spleissosomen erlauben und somit erklären wie die signal-induzierte Modifikation von Sam68 Spleißen steuern kann.

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