Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7298
Biochemische, physiologische und klimatische Einflüsse
auf die Isoprenoidemission der Graupappel (Populus x canescens (Aiton) Sm.) und
der Steineiche (Quercus ilex L.)
Sabine Mayrhofer
Zusammenfassung
Die Bedeutung von
flüchtigen Isoprenoiden für die Atmosphärenchemie erfordert genaue
Abschätzungen der globalen täglichen und saisonalen Emissionsraten der Vegetation.
Dazu ist die detaillierte Kenntnis der biochemischen und physiologischen
Vorgänge in der Pflanze unerlässlich. Experimentell charakterisierte Parameter
können dabei die nötigen Informationen für prozessbasierte Vorhersagemodelle
liefern. Zentrales Ziel dieser Arbeit war daher, Basiswissen über die
Regulation der Isoprenoidemission durch verschiedene Umweltfaktoren auf
transkriptionaler, translationaler und physiologischer Ebene zu verbessern. Die
Untersuchungen wurden an der Graupappel, als Vertreter eines starken
Isopren-Emitters und an der Steineiche, einer Monoterpen emittierenden Art,
durchgeführt. Des Weiteren wurde in der Arbeit die Hypothese, Isopren könne als
antioxidativer Schutz gegen oxidativen Stress wirken, überprüft.
1. Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden
konnte die DXR der Graupappel (PcDXR) aus einer cDNA-Genbank isoliert und
anschließend heterolog exprimiert werden. Die gesamte PcDXR-Sequenz besteht aus
1724 bp und codiert für eine Proteinsequenz aus 472 Aminosäuren. Das
Molekulargewicht des Enzyms beträgt ca. 51,3 kDa. Im Vergleich zu 15 bekannten
pflanzlichen Sequenzen konnte die höchste Ähnlichkeit der PcDXR zur DXR der A.
thaliana mit einer Homologie von 86,23% festgestellt werden. Mit Hilfe der
photometrisch gemessenen Umsetzung von NADPH durch die PcDXR konnte die
Enzymaktivität des heterolog exprimierten Proteins bestimmt werden. Durch die
spezifische Hemmung der Enzymaktivität mittels Fosmidomycin wurde die Funktionalität
der PcDXR eindeutig nachgewiesen.
2. Die tageszeitliche Variation der
physiologischen und biochemischen Kenngrößen der Isoprenemission bei der
Graupappel wurde in 2 Jahren an zweimal 2 aufeinander folgenden Tagen an
insgesamt 8 repräsentativen Bäumen ermittelt. Der photosynthetische Gaswechsel
der Pflanzen (Netto-Assimilation, Ci, Transpiration und die Stomatäre
Leitfähigkeit), DMADP-Gehalt der Blätter und die Isoprenemission folgten dem
tageszeitlichen Verlauf von Licht und Temperatur. Hingegen zeigte die in vitro
ISPS-Aktivität keine signifikante Veränderung während der Tagesgang-Messungen.
Höchsten Einfluss auf die Isoprenemission wies die Blatttemperatur auf. Die
Stomatäre Leitfähigkeit hatte keinen Einfluss auf die Isoprenemission.
3. Mittels quantitativer RT-PCR konnte in
den gleichen Blattproben gezeigt werden, dass die relativen Transkriptmengen
der PcISPS klare diurnale Verläufe mit Maxima am Vormittag aufwiesen, während
im Gegensatz dazu bei den Transkriptkonzentrationen der PcDXR kein Tagesgang
festzustellen war. Des Weiteren konnte kein kurzfristiger Einfluss der
Lichtintensität und der Blatttemperatur auf die Expression von PcDXR oder
PcISPS nachgewiesen werden.
4. Wie bei der Graupappel wurde die
tageszeitliche Variation der physiologischen und biochemischen Kenngrößen der
Monoterpenemission bei der Steineiche an zweimal 2 aufeinander folgenden Tagen
ermittelt. Als Hauptkomponenten der Monoterpenemission der Steineichenblätter
wurden α-Pinen, β-Pinen/Sabinen, Myrcen, Camphen, Limonen, p-Cymol
und Δ-3-Caren gemessen. Isopren wurde ebenfalls in der Emission
nachgewiesen. Der photosynthetische Gaswechsel der Steineichen
(Netto-Assimilation, Ci, Transpiration und die Stomatäre Leitfähigkeit), und
die Monoterpenemission folgten dem tageszeitlichen Verlauf von Licht und
Temperatur. Weder für die DMADP-Gehalte der Steineichenblätter noch für die
Summe der Mono-TPS Aktivitäten konnte ein diurnalen Verlauf nachgewiesen
werden. Höchsten Einfluss auf die Monoterpenemission wies die Blatttemperatur
auf. Im Gegensatz zur Graupappel war bei der Steineiche ein regulierender
Einfluss der Stomatären Leitfähigkeit auf die Monoterpenemission zu beobachten.
Eine schwache negative, aber signifikante Korrelation bestand zwischen DMADP
und Monoterpenemissionsrate, obwohl der DMADP-Gehalt der Blätter nicht mit den Lichtintensitäten
und den Blatttemperaturen korreliert war. Der DMADP-Gehalt der
Steineichenblätter und die in vitro Mono-TPS-Aktivität zeigten einen signifikanten,
negativen Zusammenhang.
5. Die Licht- und Temperaturabhängigkeit
der Isoprenoidemission konnte für beide Pflanzenarten bestimmt und mit Hilfe
des Guenther Algorithmus (1997) charakterisiert werden. Die Blätter der
Graupappel wiesen ein Maximum der Isoprenemission bei einer Blatttemperatur von
42°C und einer Lichtintensität von ca. 300 μmol Photonen m-2 s-1
auf. Die Monoterpenemissionsrate der Steineichenblätter war bei ca. 35°C Blatttemperatur
maximal und befand sich bereits bei etwa 250 μmol Photonen m-2
s-1 im Bereich der Sättigung.
6. Um den Einfluss von Isopren im bzw. in
unmittelbarer Umgebung des Blattes auf die Superoxidanionenradikal- (O2-.-)
Konzentration im Blattfeststellen zu können, wurden mit Hilfe von
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) die O2.--Radikale im
Blatt sichtbar gemacht. Die Isoprenkonzentration in der Umgebung der Blätter
wurde durch Begasung erhöht. Unter diesen Bedingungen konnte, verglichen zur
Kontrollbehandlung, ein signifikanter Effekt auf die O2.--Konzentrationen
im Blatt nachgewiesen werden. Die spezifische Hemmung der Isoprenbiosynthese
von Isopren-emittierenden Pappelblättern mit Fosmidomycin konnte diesen Effekt
jedoch nicht bestätigen. Eine Isoprenbegasung von Fosmidomycin-behandelten
Blättern zeigte keinen eindeutigen positiven Effekt. Ergänzende Versuche, bei
denen die endogene Isoprenkonzentration gemessen wurde, zeigten ebenfalls keine
eindeutige Reduktion der O2.--Radikale bei erhöhten,
blattinternen Isoprenkonzentrationen. Die Ergebnisse der durchgeführten
Untersuchungen sind daher bezüglich einer möglichen schützenden Wirkung von
Isopren gegen oxidativen Stress widersprüchlich und können keine klare Antwort
auf diese Frage geben.
Biochemical, Physiological and Climatic Influence on the Emission
of Isoprenoides from Gray Poplar (Populus x canescens (Aiton) Sm.) and Holm Oak
(Quercus ilex L.)
Abstract
Because of their important role for the atmospheric
chemistry, global daily and seasonal emission rates of isoprene and
monoterpenes have to be estimated with accuracy. Therefore, detailed knowledge
of biochemical and physiological processes within the plant metabolism has to
be gathered. Afterwards the gained cognitions are used as information for
process-based model calculations. The major scope of the work was therefore to
enlarge basic knowledge of the regulation of isoprenoid emission, which is
known to be dependent on several environmental factors, especially light and
temperature. Measurements of diurnal isoprene emission have been performed in
parallel on physiological, translational and transcriptional level on leaves of
Grey Poplar (Populus x canescens), a strong isoprene emitting species.
Additionally, examinations of diurnal monoterpene emission in connection to
physiologic and enzymatic processes was conducted in leaves of Holm Oak
(Quercus ilex), which emits a large spectrum of monoterpenes. Furthermore a
hypothesis was tested, whether isoprene emission may serve the plant as
antioxidative protection mechanism in order to overcome oxidative stress. In
main parts, the following results have been reached:
1. In the first part of this work, isolation of PcDXR (DXR of Grey Poplar)
from a cDNA-Genbank and heterologous expression of the isolated gene was accomplished.
The whole PcDXR-sequence consists of 1724 bp and encodes for a proteine
sequence of 472 aminoacids. The molecular weight was approximately 51,3 kDa.
Comparing the PcDXR sequence with the DXR sequences from 15 different plants,
highest similarity to the DXR of A. thaliana (86,23%) has been found. With help
of the photometrical measurement of the NADPH implementation mediated through
the PcDXR, its enzyme activity has been determined. Specific inhibition of the
enzyme by Fosmidomycin and thus decreased NADPH implementation rate
demonstrated functionality of the isolated PcDXR enzyme.
2. Daytime variation of physiological and biochemical parameters of the
isoprene emission of Grey Poplar was measured twice on 2 following days in 2
years. All together, measurements have been performed on 8 representative plants.
Photosynthetic gas exchange (netto-assimilation, Ci, transpiration
and stomatal conductance), DMADP content and Isoprene emission of the leaves followed
the diurnal course of light and temperature. In vitro ISPS activity showed no
significant diurnal changes. Strongest influence on the Isoprene emission was
shown by leaf temperature. Stomatal conductance had no influence on the
Isoprene emission.
3. Quantitative RT-PCR elucidated the gene expression pattern of PcDXR and
PcISPS in parallel to diurnal gas exchange measurements. Gene expression of
PcISPS showed distinct diurnal courses with maximum values on the late morning,
whereas PcDXR transcript levels stayed consistent over the day. No short-term
influence of PPFD and leaf temperature has been observed on the expression
rates of PcDXR or PcISPS.
4. Daytime variation of physiological and biochemical parameters of the
monoterpene emission of Holm Oak was measured the same way as for Grey Poplar.
Main components of the monoterpene emission were α-pinene, β-pinene/sabinene,
myrcene, camphene, limonene, p-cymol and Δ-3-carene and also isoprene was
detected. The photosynthetic gas exchange of the plants (netto-assimilation, Ci,
transpiration and stomatal conductance) as well as monoterpene emission
followed the diurnal course of light and temperature. For leaf DMADP content
and for the sum of Mono-TPS activities no diurnal changes have been detected.
The leaf temperature showed strongest influence on monoterpene emission. In
contrast to the measurements on Grey Poplar, a regulating influence of the
stomatal conductance on the monoterpene emission could have been observed. A
weak negative correlation has been detected for DMADP contents and the rate of
monoterpene emission, although DMADP content of the leaves showed no
correlations to leaf temperatures and light intensity. DMADP content and in
vitro Mono-TPS-activity of the Holm Oak leaves were correlated negatively to
each other.
5. Light and temperature dependency of the isoprenoide emission was characterised
for both plant species according to the Guenther algorithm (1997). Maximum
isoprene emission rate of Grey Poplar was reached at leaf temperatures of 42°C
and light intensities of approximately 300 μmol photons m-2 s-1.
Monoterpene emission rate of the Holm Oak leaves was reaching the maximum
values at a leaf temperature of 35°C and light intensities of 250 μmol photons
m-2 s-1.
6. In order to test the influence of isoprene within or in the nearest surrounding
of poplar leaves on the concentrations of superoxideanionradicals (O2.-)
Nitrobluetetrazoliumchloride (NBT) was used to make them visible. Isoprene
concentration was raised in the near surrounding of the leaf by isoprene
fumigation. Distinct influence of isoprene on the O2.--concentrations
compared to non fumigated leaves has been demonstrated under the chosen conditions.
Specific inhibition of the isoprene synthesis and emission by Fosmidomycin
showed no further confirmation of these results and also isoprene fumigation of
the inhibited leaves showed no distinct effect. Considering the influence of
the endogenous isoprene content, again no distinct effect of increased
endogenous isoprene concentrations on the O2.--concentration
could have been determined. The results concerning a possible protection effect
against oxidative stress are inconsistent and can not clarify this question.
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