Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7304
Protein-Protein-Interaktionen
der U1snRNPKomponente Prp40 und deren FF-Domänen in Saccharomyces cerevisiae
Claudia Ester
Zusammenfassung
Die FF-Domäne ist in
allen eukaryotischen Organismen konserviert. Dies deutet darauf hin, dass die
Funktion der FF-Domäne von Bedeutung ist. Die meisten FF-Domänen Proteine
spielen eine Rolle im RNA-Metabolismus und ihre FF-Domänen erscheinen
typischerweise in Serie. Der Hefe-SpleißfaktorPrp40, eine essentielle
Komponente des U1snRNP, besitzt vier FF-Domänen und scheint eine wichtige Rolle
in der Stabilisation des Hefe Commitment-Komplexes im Spleißosom zu spielen.
Die Funktion der FF-Domänen in diesem Prozess ist dabei unklar. FF-Domänen von
Prp40 und den menschlichen Proteinen CA150 und HYPA/FBP11 binden bekannter
weise an die phosphorylierte Cterminale Domäne (CTD) der RNA Polymerase II.
Durch genomweite Yeast-2-Hybrid (Y2H)-
Screens wurden für die FF-Domänenregion von Prp40 zwei Interaktionspartner
Snu71 und Luc7 identifiziert, bekannte Komponenten des U1snRNP.
Kartierungsversuche zeigten, dass die FF1-Domäne von Prp40 mit einer C-terminalen
Region in Luc7 interagiert, was auch durch in vitro Bindeversuche bestätigt
wurde, während die FF2-3 Region mit einer Cterminalen Region in Snu71
interagiert.
Peptidarray-Ergebnisse zeigten eine Interaktionsregion
in Snu71 (NDVHY), die keine Ähnlichkeit zu einem für Luc7 durch
Substitutionsanalysen identifizierten Motiv (Φ[FHL]x[KR]x[GHL]) aufweist.
Mutationen der involvierten Aminosäuren in der Luc7-Sequenz zeigten nicht den
erwarteten Effekt in Y2H-Versuchen. Nur eine Mutation von Lysin resultierte in
einem Verlust der Bindung mit Prp40, aber nur in einem verlangsamten Wachstum
der Hefezellen mit FF1. Auch ein Peptid mit der identifizierten
Interaktionsregion von Luc7 blockierte nicht die Bindung der FF1-Domäne mit
Luc7 in einem Kompetitions-Versuch. Vergleiche des für Luc7 identifizierten
Motivs mit zuvor charakterisierten Konsensussequenzen für FF-Domänen, ergab
keine Ähnlichkeit, was die Identifikation einer neuen Bindestelle für
FF-Domänen bedeuten könnte.
Um einen besseren Einblick in die
Wechselwirkungen des Hefe-U1snRNP zu bekommen, wurden alle U1snRNP-assoziierten
Proteine in Y2H-Versuchen auf Interaktion getestet. Aber nur die Bindung von
Prp40 mit Snu71 und Luc7 wurde erneut detektiert. Wahrscheinlich wird dieser
Komplex über RNAProtein- Interaktionen zusammengehalten.
In vivo FF-Domänen-Deletionen in Prp40
ergaben eine Mutante mit Wachstumsdefekt, der wahrscheinlich auf einem Defekt
im Spleißmechanismus beruht. Dies wurde durch einen funktionellen Spleißtest
mit zwei repräsentativen Intron-Genen überprüft, zeigte aber keinen Einfluss
auf den Spleißvorgang. Um alle Intron-Gene in Hefe zu detektieren, wurde eine
Microarray-Spleißtest initiiert, um genomweite Ergebnisse zu bekommen.
Basierend auf allen Interaktionsstudien,
wird von uns angenommen, dass die drei U1snRNP-Proteine Prp40, Snu71 und Luc7
einen Subkomplex innerhalb des U1snRNP, vermittelt durch die FF-Domänen von
Prp40, bilden, wie die menschlichen U1snRNP-Proteine U1-A, U1-70K und U1-C.
Protein-protein-interactions of the U1snRNP-component Prp40
and its FF-domains in
Saccharomyces cerevisiae
Abstract
The FF domain is conserved in all eukaryotes indicating an
important biological role. Many FF domain proteins play a role in RNA
metabolism and their FF domains typically occur in tandem arrays. The yeast
splicing factor Prp40 an essential component of the U1snRNP contains four FF
domains and appears to play a role in stabilization of the yeast commitment complex
during spliceosome assembly. The function of the FF domains in this process is
unclear. FF domains of Prp40 and the human proteins CA150 and HYPA/FBP11 are
known to interact with the phosphorylated C-terminal domain (CTD) of the RNA
polymerase II.
By yeast genome-wide two-hybrid screens I found that FF domains of Prp40
specifically interact with Snu71 and Luc7, known components of the U1snRNP.
Mapping experiments showed that the FF1 domain of Prp40 interacts with a
C-terminal region within Luc7, also confirmed by in vitro binding assays,
whereas FF2-3 domains interact with a C-terminal region within Snu71.
Peptide array results showed an interaction region within Snu71 (NDVHY)
with no similarity to the consensus motif for Luc7 (Φ[FHL]x[KR]x[GHL])
identified via substitution analysis.
Mutations of involved amino acids within the Luc7 sequence showed not the
expected effect in Y2H experiments with FF domains. Only a mutation of the
lysine resulted in the loss of binding with Prp40, but only in slow growth of
yeast cells with FF1. Also a peptide containing the identified interacting
region from Luc7 did not block the binding of FF1 and Luc7 in competition
assay. Comparison of the identified motif for Luc7 with previous characterised
consensus sequences from FF domains revealed no similarity, indicating the
identification of a novel binding site for FF-domains.
To get more insight into the yeast U1snRNP interactions also all
associated proteins were tested in Y2H experiments. But only the interaction
from Prp40 with Snu71 and Luc7 was detected again, concluding that this complex
is hold together also through protein-RNA interaction.
In vivo FF-domain deletions in Prp40 produced a mutant with growth defect
lacking FF domains four and three, probably due to a defect in splicing. This
was tested by a functional splice test with two representative intron
containing genes, with no influence on splicing. To achieve all intron
containing genes in yeast also microarray-splice experiments were initiated to
obtain genome wide results.
Based on all interaction studies, we conclude, that these three U1snRNP
proteins Prp40, Snu71 and Luc7 build a sub complex within the U1snRNP via
FF-domain interactions, like U1-A, U1-70K and U1-C in the human U1snRNP.
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