Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7306

Molekulare Mechanismen und funktionelle Konsequenzen der WHIM-Syndrom-Mutation des Chemokin-Rezeptors CXCR4 in T-Lymphozyten

Jan Adam

Zusammenfassung
Das WHIM-Syndrom ist eine autosomal dominant vererbte Krankheit, deren Ursache kürzlich auf eine Mutation des heptahelikalen Chemokinrezeptors CXCR4 zurückgeführt wurde, die zur Deletion des regulatorischen C-Terminus des Rezeptors führt. Charakteristisch ist das Auftreten verschiedenartiger Symptome wie Immunschwäche, einhergehend mit niedrigem IgG-Spiegel (Hypogammaglobulinämie), kutanen Warzen durch Infektion mit humanen Papillomaviren und Retention von Neutrophilen im Knochenmark, was zu niedrigen Neutrophilwerten im Blut führt (Myelokathexis).

CXCR4 und sein einziger Ligand SDF-1α spielen eine wichtige Rolle für die Migration und Homöostase einer Reihe von Zellpopulationen während der Embryogenese und im Immunsystem des adulten Organismus, insbesondere in T-Lymphozyten. SDF-1α leitet die T-Zellen zu den sekundären lymphatischen Organen, wirkt als Costimulus in der T-Zellaktivierung und inhibiert IL-2 induzierte Proliferation zur Eindämmung der Immunantwort. Letzterer Effekt wird durch Rho A vermittelte Inhibierung der Ras-Raf-MEK-ERK-Aktivierung verursacht. Außer Rho A werden zahlreiche andere Signalwege durch SDF-1α aktiviert, unter anderem die Schlüsselregulatoren PLCγ, PI3K und Calcium.

In WHIM-Syndrom-Patienten wurden Deletionen des CXCR4-C-Terminus unterschiedlicher Länge gefunden, die alle das Fehlen von Phosphorylierungstellen gemeinsam haben, welche für die Internalisierung eine Rolle spielen. Tatsächlich zeigt CXCR4WHIM eine defekte Internalisierung. Als Folge davon ist die Signaltransduktion im Vergleich zum Wildtyp-Rezeptor dereguliert, was zu einer verstärkten und verlängerten Calciumantwort auf SDF-1α führt.

Zur Untersuchung weiterer Auswirkungen der Mutante auf T-Zellen wurde ein Doxycyclin induzierbares in-vitro T-Zellmodell zur Expression von CXCR4_WT bzw. CXCR4_WHIM hergestellt und validiert. Funktionelle Analysen zeigten, dass CXCR4_WHIM exprimierende Zellen eine Reihe von Parametern zeigen, die auch in anergen T-Zellen beobachtet werden: Sie reagierten nicht auf das Stoppsignal durch TCR- und Corezeptorstimulierung, zeigten eine verminderte Aktivierung des TF NFAT und des Ras-Signalwegs und folglich eine verminderte IL-2-Expression und Proliferation. Die Inhibierung des Ras-Signalwegs über Rho A wurde als Mechanismus ausgeschlossen. Stattdessen wurde ebenso wie in anergen primären T-Zellen eine erhöhte Expression von DGK gefunden, welche den Ras-Aktivator DAG inaktiviert. Spezifische Inhibierung von DGK stellte die Aktivierung des ERK-Signalwegs sowie die IL-2-Produktion wieder her. Die erhöhte DGK-Expression kann jedoch nicht alleinige Ursache der Anergie sein, da in CXCR4_WHIM exprimierenden Zellen auch die Aktivierung von LAT inhibiert wird, welches oberhalb von DAG in der Signalkaskade liegt.

Consequences of the WHIM syndrome CXCR4 mutation in T cells

Abstract
The WHIM syndrome is an autosomal dominantly inherited disease which has recently been shown to be caused by mutation of the heptahelical chemokine receptor CXCR4 leading to deletion of the regulatory C-terminus. Typical findings in patients are immunodeficiency with low IgG-levels (hypogammaglobulinemia), cutanous warts caused by HPV infection and retention of neutrophils in the bone marrow leading to low peripheral neutrophil counts (myelokathexis).

CXCR4 and its only known ligand SDF-1α play important roles during embryogenesis and in the immune system of the adult organism, particularly in T-lymphocytes. SDF-1α guides T cells to the secondary lymphoid organs, acts as a costimulus in T cell activation and inhibits IL-2 induced proliferation to attenuate the immune response. The latter effect is triggered by Rho A mediated inhibition of Ras-Raf-MEK-ERK-activation. Besides Rho A numerous additional pathways are activated by SDF-1α including the important key regulators PLCγ, PI3K and calcium. In WHIM syndrome patients CXCR4 C-terminal deletions of different length have been found, all missing phosphorylation sites playing a role in internalization. Indeed CXCR4_WHIM shows a defect in internalization. As a consequence, signaling is deregulated leading to an enhanced and prolonged calcium answer upon SDF-1α stimulation.

To explore further effects of the mutation on T-cells a Doxycyclin-inducible invitro T-cell model was generated and validated. Functional analyses showed that CXCR4_WHIM expressing cells show a number of parameters that can also be observed in anergic T cells: They don’t react on the stop-signal generated by TCR- and coreceptor-stimulation, they show a decreased activation of the transcription factor (TF) NFAT and of the Ras pathway and consequently an impaired IL-2 expression and proliferation. Inhibition of Ras signaling through Rho A was excluded as a relevant mechanism. Instead, like in anergic primary T cells, an enhanced expression of DGK was found leading to inactivation of the Ras-activator DAG. Specific inhibition of DGK reconstituted activation of the ERK pathway and IL-2 production. Nevertheless, enhanced DGK expression could not be the only cause of anergy because activation of LAT upstream of DAG was also inhibited in CXCR4_WHIM expressing cells.

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