Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7324
Der Ko-Rezeptor CD44 v6: Ein Beitrag zur
Signaltransduktion und Etablierung einer CD44-negativen Maus
Thor Kastilan
Zusammenfassung
CD44 ist ein
Zelladhäsionsmolekül, das in einer Vielzahl zellulärer Prozesse involviert ist.
Neben seiner Funktion in der Zell-Matrix-Adhäsion ist es in einigen Zelltypen
an der Bildung eines Signalkomplexes, bestehend aus der Isoform CD44 v6, der
Rezeptor-Tyrosinkinase c-Met und dem ERM-Protein Ezrin, beteiligt.
Um die Rolle von Ezrin sowie der zytoplasmatischen
Domäne von CD44 v6 bei der Signaltransduktion von c-Met zu untersuchen, wurden
Fusionsproteine generiert, in denen Ezrin direkt an die Transmembran-Domäne von
CD44 v6 gekoppelt wurde. Bei der Untersuchung der Funktionalität des
Fusionsproteins bezüglich der Weiterleitung der c-Met Signalkaskade zeigte
sich, dass die Deletion der zytoplasmatischen Domäne von CD44 v6 keine
Auswirkung auf die Weitergabe des Signals hat. Sie scheint dafür verantwortlich
zu sein, Ezrin in einen Komplex mit c- Met zu bringen. Um die Funktion von
Ezrin im Signalkomplex zu bestimmen, wurde es verschiedentlich modifiziert.
Durch die Deletion der F-Aktin-Bindedomäne kam es zu einem Abbruch der
Weiterleitung des HGF/SF-induzierten Signals, was der Aktin-Bindung in diesem Prozess
eine essentielle Rolle zuweist.
Im zweiten Teil der vorliegenden
Dissertation sollte ein konditioneller Knockout von CD44 in der Maus etabliert
werden. Aus Knockouts, die auf einer Zerstörung der Gen-Struktur basieren,
konnte keine eindeutige Funktion von CD44 in der Entwicklung abgeleitet werden,
während es bei einem transgenen antisense-Knockout zu einem drastischen
Phänotyp kam. Um die Rolle von CD44 in der Embryogenese zu bestimmen und eine
mögliche Substitution zu untersuchen, sollte daher ein induzierbarer
konditioneller Knockout generiert werden.
Als Strategie wurde für die Inaktivierung
von CD44 die Exzision von Exon 3 durch das Cre-LoxPSystem gewählt. Die beiden
Exon 3 flankierenden LoxP-Rekombinationsstellen wurden über homologe
Rekombination mit den endogenen Sequenzen in die genomische DNA von ES-Zellen inseriert.
Dafür wurde ein Knockout-Vektor kloniert, welcher alle für die Inaktivierung notwendigen
Komponenten, flankiert von homologen Sequenzen, enthält. ES-Zell-Klone mit
einer homologen Integration der LoxP-Sequenzen wurden in Blastozysten
injiziert, welche in Leihmütter transferiert wurden. Fünf chimäre Mäuse wurden
geboren, von denen ein stark chimäres Weibchen nach kurzer Zeit starb. Die
übrigen wurden für die Etablierung einer homozygoten CD44-Knockout Mauslinie
mit BL/6 Mäusen verpaart.
Der nächste Schritt wäre die Aktivierung
des Knockouts durch die Verpaarung einer homozygoten Knockout-Maus mit einer
Cre-Rekombinase-exprimierenden Maus. Die resultierende Deletion von Exon 3 hat
die Bildung einer nonsense-mRNA und deren Abbau vor Beginn der Translation von CD44
zur Folge. Dabei sollte die Expression der Cre-Rekombinase unter der Kontrolle
eines spezifischen Promotors stehen, welcher so gewählt wird, dass die
Inaktivierung zur Aufklärung der Funktionen von CD44 in der Embryogenese
beitragen kann.
The co-receptor CD44 v6: Its contribution to signal
transduction and the establishment of a CD44 null mouse
Abstract
The cell adhesion molecule CD44 is involved in many cellular
processes. Beside its function in cellmatrix adhesion CD44 is involved in the
formation of a signaling complex involving the isoform CD44 v6, the receptor
tyrosin kinase (RTK) c-Met and the ERM-protein ezrin in many cell types. Indeed,
the CD44 tail recruits ERM proteins as well as the cytoskeleton in order to
promote signaling from the c-Met RTK.
In order to test whether the CD44 tail is there to bring ERM proteins to
the membrane, fusion proteins were generated in which ezrin was fused directly
to the transmembrane domain of CD44 v6. These fusion proteins were able to
promote signaling indicating that ERM proteins have to be maintained at the
membrane to fulfill their function. The cytoplasmic domain of CD44 seems to be responsible
to bring ezrin into a complex with c-Met. To determine the role of ezrin in the
signaling complex, this protein was modified in different ways in the fusion
protein. Deletion of the F-actin binding domain in ezrin blocked HGF/SF induced
signaling pointing towards an essential role of actin in this process.
The aim of the second part of my PhD work was to establish a conditional
knockout of CD44 in mice. The classical CD44 knockout mouse showed no overt
phenotype, whereas a transgenic antisense knockout resulted in a drastic
phenotype. To determine the role of CD44 in embryogenesis and to test whether a
substitution had occurred in the classical knockout mouse, a conditional
knockout mouse should be generated. A construct containing exon 3 flanked by
LoxP sites included in genomic DNA was transfected into ES cells. ES cell
clones harboring homologous integration of the LoxP sites containing sequences
were injected into blastocytes and transferred into surrogate mothers. Five
chimeric mice were born, the strongest chimera, a female, died after three
weeks. The remaining mice were crossed with BL/6 mice to establish a homozygote
CD44 knockout mouse line.
The next step is the inactivation of CD44 by crossing the homozygote
knockout mouse with a Cre recombinase expressing mouse. The deletion of exon 3
results in the production of a nonsensemRNA which is degraded by NMD
(nonsense-mediated mRNA decay). The expression of the Cre recombinase should be
under the control of a time specific inducible or tissue specific promoter. These
crossings will help to explain the functions of CD44 in embryogenesis.
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