Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7421
Effects of N-terminal mutations of human androgen receptor on
polyglutamine toxicity
Sarah F. Funderburk
Abstract
Nine neurodegenerative diseases are caused by polyglutamine
(polyQ) tract amplification in different proteins. The cytotoxicity of each of
these proteins is associated with a misfolding of the mutant protein, resulting
in the subsequent alteration of cellular processes and interactions as well as
the interrelated formation of insoluble aggregates and other conformationally
toxic species. However, the diseases differ in their pathology and tissue
specificity of action, which may be due to protein context/regions neighboring the
polyQ stretch.
For the purpose of the studies presented in ths work, the
polyQ containing human androgen receptor (AR) that causes the disorder spinal
and bulbar muscular atrophy (SBMA) was used to model polyQ toxicity. In
previous investigations, two putative phosphorylation sites of the AR were
identified, and it was demonstrated that mutation of these sites appeared to
cause conformational change in the protein. Therefore, these N-terminal serine
residues were exchanged to alanine in the wild type AR (ARQ22/ARQ22dm) or a
receptor with an amplified polyQ stretch (ARQ77/ARQ77dm). These mutants were
then used to characterize variance in types of aggregates and the associated
toxic profiles due to the different protein conformations that arose from the serine
mutations.
Evaluating changes in aggregation and toxicity in cultured
cells and in a Drosophila model of SBMA, it was found that the effects of the
conformational changes differed depending on the length of the polyQ stretch. Mutations
in the ARQ22 resulted in a marked increase in aggregation as well as decreased
survival rates and altered locomotion behavior in Drosophila. These results
were similar but not as severe as the ARQ77/SBMA model. In quite the opposite
manner, mutations in the ARQ77 caused a decrease in aggregation and a lessened
toxic effect in Drosophila. Moreover, it was found that inhibitor compounds
used to ameliorate polyQ toxicity were not as efficient in inhibiting the
varied toxicities exhibited by both the ARQ22dm and ARQ77dm. Therefore, two
distinct amino acid sites that profoundly modulate polyQ toxicity in the AR
have been identified. These results can be further utilized to understand the conformational
changes in the AR that lead to aggregation as well as the types of aggregates
that lead to toxicity.
Effekte N-terminaler
Mutationen des humanen Androgenrezeptors auf die Polyglutamintoxizität
Zusammenfassung
Neun neurodegenerative
Krankheiten sind auf die Verlängerung einer Polyglutamin (PolyQ) Sequenz in
unterschiedlichen Proteinen zurückzuführen. Die Zytotoxizität von jedem dieser
Proteine ist mit einer Fehlfaltung des mutierten Proteins assoziiert. Dadurch
kommt es zu Veränderungen in zellulären Prozessen und Interaktionen, sowie der
damit verbundenen Bildung von unlöslichen Aggregaten und anderen toxisch
wirkenden Spezies. Die Polyglutaminerkrankungen unterscheiden sich jedoch in
ihrer Pathogenese und gewebespezifischen Wirkung, was auf den jeweiligen Proteinkontext
bzw. PolyQ-angrenzenden Sequenzbereich zurückzuführen sein könnte.
Für die Studien der
hier vorliegenden Arbeit wurde der polyglutaminhaltige humane Androgenrezeptor
(AR), Auslöser der spinalen und bulbären Muskelatrophie (SBMA), als Modell
verwendet, um die Toxizität der PolyQ-Verlängerung zu analysieren. In früheren
Experimenten wurden zwei mögliche Phosphorylierungsstellen im AR identifiziert,
und die Mutation dieser Stellen schien eine Konformationsänderung im Protein
hervorzurufen. Ausgehend von diesen Befunden wurden nun diese N-terminalen Serin-Reste
im Wildtyp AR (ARQ22) sowie in einem Rezeptor mit einer verlängerten PolyQ
Sequenz (ARQ77) gegen Alanin ausgetauscht (ARQ22dm bzw. ARQ77dm). Mit Hilfe
dieser Mutanten wurde dann der Effekt der durch die Serinmutation erzeugten
Konformationsänderung auf die jeweiligen Aggregatformen und die damit
verbundenen Toxizitätsprofile charakterisiert.
Die Untersuchungen
der Aggregation und Toxizität in kultivierten Zellen und in einem SBMA
Drosophila Modell ergaben, dass sich die Effekte der Konformationsänderungen in
Abhängigkeit von der Länge der PolyQ Sequenz unterscheiden. Im ARQ22 verursachten
die Mutationen eine deutliche Verstärkung der Aggregation, sowie eine
verminderte Überlebensrate und ein verändertes Bewegungsverhalten in
Drosophila. Diese Veränderungen ähnelten dem Phänotyp des ARQ77/SBMA Modells,
waren jedoch etwas schwächer ausgeprägt. Im Gegensatz dazu führten die
Mutationen im ARQ77 zu einer Herabsetzung und Abschwächung der Aggregatbildung
und Toxizität. Darüber hinaus erwiesen sich Inhibitoren, die zur Milderung der
PolyQ Toxizität eingesetzt werden, als nicht sehr effektiv in der Hemmung der
durch den ARQ22dm und AR77dm verursachten Toxizität. Somit wurden in dieser
Arbeit zwei Aminosäurestellen identifiziert, welche die PolyQ-Toxizität des AR in
gravierender Weise modulieren. Diese Ergebnisse können zukünftig genutzt
werden, um zu klären, welche konformationellen Veränderungen im AR zur
Aggregation führen und welche Aggregatformen für dessen toxische Wirkung
verantwortlich sind.
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